【摘要】：水稻是重要的糧食作物,世界上有半數(shù)人口以大米為主食,隨著我國(guó)人口的不斷增加,生活水平的不斷提高,對(duì)稻米品質(zhì)多樣化要求更高,給廣大育種工作者帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)育種周期長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣,而基因編輯技術(shù)為水稻重要農(nóng)藝性狀,特別是品質(zhì)性狀的快速改良提供了可能,可用于水稻品種間的改良育種。在本實(shí)驗(yàn)中我們以控制水稻粒長(zhǎng)基因(GS3)、香味基因(BADH2)、溫敏雄性不育基因(TGMS5)和影響水稻籽粒γ-氨基丁酸基因(OsGABA-1)作為研究對(duì)象;以本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)育成的秈、粳稻親本為轉(zhuǎn)化受體,運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)分別對(duì)上述4個(gè)基因進(jìn)行敲除,以期人工定向的改造育種材料,縮短育種進(jìn)程。主要研究結(jié)果如下:(1)GS3與BADH2基因編輯GS3基因是控制水稻粒長(zhǎng)的主效基因,對(duì)粒長(zhǎng)具有負(fù)調(diào)控的作用。BADH2基因是調(diào)控水稻稻米香味基因。通過(guò)構(gòu)建CRISPR/Cas9雙敲載體轉(zhuǎn)化秈型雜交稻恢復(fù)系蜀恢573、保持系廣8B和粳稻材料粳稻保持系遼39B、常規(guī)稻川農(nóng)粳1號(hào)的愈傷組織,獲得不同背景下轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。在T2代對(duì)GS3與BADH2共敲除的陽(yáng)性植株進(jìn)行表型鑒定分析,獲得了具有香味的秈稻恢復(fù)系蜀恢573和保持系廣8B,且農(nóng)藝性狀與野生型無(wú)顯著差異。粳稻保持系遼39B和常規(guī)粳稻川農(nóng)粳1號(hào)的陽(yáng)性突變體植株與野生型比較,粒長(zhǎng)變的更短、有香味,其他農(nóng)藝性狀沒(méi)有發(fā)生明顯變化。(2)富含γ-氨基丁酸功能稻的創(chuàng)建OsGABA-1是編碼水稻體內(nèi)γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的基因,它負(fù)調(diào)控水稻中γ-氨基丁酸(GABA)的含量。通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯,對(duì)水稻的兩個(gè)粳稻品種川農(nóng)粳1號(hào)和川農(nóng)香粳的OsGABA-1基因進(jìn)行敲除。獲得不同敲除背景下純合的陽(yáng)性植株。突變體表型分析發(fā)現(xiàn)堊白度比野生型顯著增加。對(duì)突變體成熟種子中各種氨基酸以及γ-氨基丁酸含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn),突變體中γ-氨基丁酸含量顯著增加,而其他農(nóng)藝性狀并沒(méi)有發(fā)生顯著變化,可用于預(yù)防高血壓功能稻的開(kāi)發(fā)。(3)溫敏不育材料的創(chuàng)制水稻兩系不育系具有育性受核基因控制,不受恢保關(guān)系限制且配組相對(duì)自由、種子繁育程序較為簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)兩個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的粳稻品種川農(nóng)香粳和遼寧引粳進(jìn)行溫敏不育基因TGMS5的編輯,獲得純合陽(yáng)性突變體植株。在T2代轉(zhuǎn)基因株系通過(guò)分期播種種植在海南,使其遭遇不同的高、低溫環(huán)境。發(fā)現(xiàn)在低溫環(huán)境下表現(xiàn)可育,能夠正常結(jié)實(shí),在高溫環(huán)境下突變體表現(xiàn)為雄性部分不育。這說(shuō)明通過(guò)TGMS5功能突變可人工創(chuàng)建溫敏不育系。充分?jǐn)U大水稻兩系不育的種質(zhì)資源,更好地應(yīng)用于兩系育種研究中。
【圖文】：

TALENs）[7]、成簇的規(guī)O摷涓艫畝袒匚鬧馗蔥蛄校–RISPR/Cas9）[8]，發(fā)展到如今，RISPR/Cas9 基因編輯作為一門(mén)基本的操作技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各生物領(lǐng)域。這些基因編輯技術(shù)的作用原理相同，都能對(duì)各模式生物體內(nèi)基因組的特定部位進(jìn)精準(zhǔn)切割 DNA 雙鏈，導(dǎo)致目標(biāo) DNA 的互補(bǔ)雙鏈斷裂（DSBs），生物細(xì)胞內(nèi)的互補(bǔ)NA 雙鏈斷裂能夠提高染色體自由重組的概率。DSBs 在真核生物細(xì)胞中的修復(fù)機(jī)制度保守，主要包括同源重組（HDR）修復(fù)途徑和非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)途徑（圖 1）。細(xì)胞存在同源序列供體時(shí)，以 HDR 的方式修復(fù)能夠在生物體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生準(zhǔn)的定點(diǎn)缺失，而沒(méi)有同源序列供體時(shí)，生物細(xì)胞內(nèi)會(huì)通過(guò) NHEJ 途徑修復(fù)，其中于 NEHJ 途徑不像 HDR 那樣精確，在目標(biāo) DNA 斷裂的位置常常會(huì)產(chǎn)生少量核酸堿的插入或者缺失，從而導(dǎo)致基因突變。而我們常獲得的陽(yáng)性植株中插入或缺失，一就是通過(guò) NEHJ 途徑所產(chǎn)生的。

圖 2. ZFNs 切割目的 DNA序列示意圖Fig.2 The sketch map for ZFNsFNs 基因編輯技術(shù)廣泛應(yīng)用于果蠅、擬南芥、人類(lèi)干細(xì)胞、煙草和玉米等生物點(diǎn)基因編輯，該編輯技術(shù)具有廣泛的發(fā)展?jié)摿�。如在作物遺傳改良方面，ZF今僅在玉米性狀改良上有一例報(bào)道，即在 2009 年《Science》報(bào)道，，SHUKL對(duì)玉米中的 IPK1 基因進(jìn)行 ZFNs 編輯，從而獲得了 IPK1 玉米突變體具有積累
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S511

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本文編號(hào)：2617139