【摘要】：本試驗以蘋果砧木M26為材料,在前期磷酸化蛋白組學測序的基礎上,篩選出TFIIE(General transcription factor IIE subunit 1-like)、ACBP4(Acyl-CoA-binding domain-containing protein 4)和MAP70-1(Microtubule-associated protein 70-1-like)差異蛋白,再通過RT-PCR法克隆TFIIE、ACBP4和MAP70-1基因,同時構(gòu)建植物雙元表達載體,利用農(nóng)桿菌介導法將上述三個基因成功導入WS Columbia擬南芥(Arabidopsis thaliana)植株中,并應用PEG脅迫對TFIIE、ACBP4和MAP70-1基因進行功能鑒定。主要研究結(jié)果如下:1.克隆得到TFIIE、ACBP4和MAP70-1基因,基因登錄號分別為MG878870、MG878871、MG878872。TFIIE和ACBP4基因,片段大小分別為1413 bp、2016 bp,均與白梨氨基酸序列同源性最高,分別為97.87%、94.82%;MAP70-1基因片段大小為1860bp,與草莓MAP70-1氨基酸序列同源性高達91.20%。2.熒光定量PCR顯示,M26蘋果盆栽苗在持續(xù)控水20 d、40 d和60 d時,TFIIE的表達水平均上調(diào);ACBP4的表達水平下調(diào);MAP70-1的表達相對穩(wěn)定。3.構(gòu)建組成型啟動子35S驅(qū)動的植物雙元表達載體,并成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,命名為pBI121/TFIIE/EHA105、pBI121/ACBP4/EHA105、pBI121/MAP70-1/EHA105。4.分別轉(zhuǎn)化獲得3個基因的轉(zhuǎn)基因T_2代擬南芥植株。經(jīng)15%PEG脅迫處理,轉(zhuǎn)基因擬南芥中TFIIE基因上調(diào)2.35倍,ACBP4基因下調(diào)1/3,MAP70-1基因與對照無顯著性差異。這3個基因的T_2代轉(zhuǎn)基因種子在PEG脅迫下的萌發(fā)率分別為90.3%、76.23%和88.66%,成活率分別為79.68%、28.30%和54.35%。
【圖文】：

甘肅農(nóng)業(yè)大學 2018 屆碩士學位論文雜帶污染，將擴增片段從凝膠中回收，用于下一步的試驗。目的片段與M-T 載體連接之后，轉(zhuǎn)化為重組子，利用 α-互補選擇法篩選純化，在涂有l(wèi)、IPTG、Amp 的平板上，挑取白色菌落為重組子，藍色菌落為非重組子，組子搖起的菌液為模板進行 PCR 擴增檢測，，獲得與目的條帶大小一致的單帶。測序結(jié)果為 TFIIE 基因片段大小為 1413bp，ACBP4 基因片段大小為bp，MAP70-1 基因片段大小為 1860bp。M 1 2M 1 2M 1 2

甘肅農(nóng)業(yè)大學 2018 屆碩士學位論文22圖2-4 蘋果砧木 ACBP4與其他植物 ACBP4同源蛋白的多序列比對分析Fig. 2-4 Mutiple sequence alignment analysis of ACBP4 with ACBP4 homologs from other plants將 MAP70-1 編碼的氨基酸序列與相近物種的氨基酸序列進行多序列比對分析（圖 2-5），結(jié)果顯示 MAP70-1 與其他物種的總相似度達到 90.74 %，與蘋果（Malus x domestica XM_008390949.2）的同源性最高，為 95.48 %；與甜櫻桃（Prunus avium XM_021965382.1）的同源性為 94.38 %，與桃（Prunus persicaXM_007221942.2）的同源性為 94.22 %，與草莓（Fragaria vesca XM_004297386.2）的同源性為 91.20 %，與葡萄（Vitis vinifera XM_002284868.3）的同源性為83.05 %，與甜橙（Citrus sinensis XM_006469189.2）的同源性為 83.23 %。蘋果 Malus x domestica白梨 Pyrus
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S661.1

【參考文獻】

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本文編號：2615323