【摘要】：小麥根腐病是由多種病原菌引起的世界性土傳病害,不同地區(qū)病原菌差異較大,麥根腐平臍蠕孢是黃淮麥區(qū)小麥根腐病的病原菌。目前對(duì)麥根腐平臍蠕孢的形態(tài)、分類等方面已進(jìn)行廣泛研究,但對(duì)其致病分子機(jī)理研究很匱乏。本論文通過遺傳學(xué)方法分析分泌蛋白CsSp3和CsSp4在病原菌致病中的作用,為麥根腐平臍蠕孢的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ),為麥根腐平臍蠕孢的有效防控提供一定的依據(jù)。分泌蛋白在病原菌與植物互作系統(tǒng)中扮演著十分重要的角色,通過對(duì)植物病原分泌蛋白功能及其作用機(jī)制的研究極大地促進(jìn)了對(duì)植物致病性的了解。通過對(duì)麥根腐平臍蠕孢與小麥互作的轉(zhuǎn)錄組分析,鑒定到4個(gè)具有相同表達(dá)模式且在侵染階段誘導(dǎo)表達(dá)的基因。分析其蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)均具有分泌蛋白典型的特點(diǎn),包括N端典型的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)及多個(gè)糖基化和絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn),由此初步判定為分泌蛋白,并分別命名為CsSP1(Cochliobolus sativus Secreted Protein gene 1)、CsSP2、CsSP3、CsSP4。前期獲得CsSP1基因缺失突變體菌株,其致病性喪失,由此推測(cè)其他的分泌蛋白可能也具有類似的功能。本研究分析了CsSP3和CsSP4在麥根腐平臍蠕孢侵染過程中的功能,主要結(jié)果如下:采用反向遺傳學(xué)的研究思路,利用split-marker方法構(gòu)建含有HYG(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)基因的敲除盒,通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和體內(nèi)同源重組得到抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子。利用PCR初步篩選,經(jīng)Southern驗(yàn)證,獲得CsSP3基因的缺失突變體。CsSP3基因及上游1.6kb啟動(dòng)子區(qū)域共同構(gòu)建到3′端含有GFP序列的pKNTG載體上,轉(zhuǎn)入(35)cssp3突變體中,獲得基因互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子。生物學(xué)性狀測(cè)定結(jié)果顯示,與野生型和互補(bǔ)菌株相比,(35)cssp3在菌落形態(tài)、菌落生長速度和產(chǎn)孢量方面沒有明顯差別。而利用分生孢子接種小麥和大麥葉片及小麥胚芽鞘,結(jié)果顯示(35)cssp3雖然能侵染發(fā)病,但在葉片和胚芽鞘上形成的病斑明顯減小,說明(35)cssp3參與麥根腐平臍蠕孢的致病性;盆栽接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,(35)cssp3突變體和CK對(duì)照的小麥的地上和地下部分的生長量沒有明顯差別,但野生型菌株明顯抑制小麥根部伸長,顯示(35)cssp3突變體抑制小麥營養(yǎng)生長的能力下降,表明CsSP3基因與麥根腐平臍蠕孢對(duì)小麥葉片和莖基部的致病性有關(guān),可能參與侵染小麥根部的次生代謝過程,進(jìn)而抑制寄主小麥根的伸長。為了明確CsSP3編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位,構(gòu)建了RP27強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CsSP3-GFP過量表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化野生型菌株,通過對(duì)其分生孢子、芽管、營養(yǎng)菌絲和洋蔥表皮模擬侵染的附著胞和侵染菌絲的熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CsSp3-GFP融合蛋白定位于液泡內(nèi),通過尼羅紅染色證實(shí)CsSp3-GFP融合蛋白與液泡中的脂滴共定位,在幼嫩分生孢子、芽管和附著胞中多在聚集融合的大脂滴上,侵染菌絲的脂滴小且較分散,推測(cè)CsSP3可能與脂肪代謝和甘油運(yùn)輸至附著胞維持侵染膨壓有關(guān)。綜合上述結(jié)果,推定的具有編碼信號(hào)肽分泌蛋白的CsSP3基因與麥根腐平臍蠕孢對(duì)寄主葉片的致病性有關(guān),并參與某種次生代謝過程來抑制小麥根部生長,編碼產(chǎn)物定位于液泡并與脂滴共定位,可能與脂肪氧化和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān),為麥根腐平臍蠕孢的生長提供能量,并維持附著胞高膨壓,有利于突破寄主小麥的第一道防御屏障,建立寄生關(guān)系。同樣的策略,成功獲得CsSP4基因的敲除突變體,但突變體在菌落形態(tài)、生長速度、產(chǎn)孢量及致病性方面與野生型沒有明顯差別。
【圖文】：

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文病的小麥植株也會(huì)產(chǎn)生新的分生孢子，通過刮風(fēng)或者下雨的方式進(jìn)行傳播并侵染其麥植株，加重病害。當(dāng)麥子成熟時(shí)，收獲帶有麥根腐平臍蠕孢的種子和殘留在病殘、土壤中的菌絲體或分生孢子將會(huì)繼續(xù)對(duì)第二年的小麥造成侵染[17]。據(jù)報(bào)道，麥根蠕孢的分生孢子可以在土壤中存活，且在不同地區(qū)的土壤中存活時(shí)間不一，在巴西的麥根腐平臍蠕孢分生孢子甚至可在土壤中存活 37 個(gè)月[18]。

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文根腐病已成為黑龍江省的第二大病害[9]。近年來，由于秸稈返田措施的的改變和氣候條件的變化[28]，小麥根腐病在我國呈現(xiàn)不斷加重的趨勢(shì)，已經(jīng)成為了小麥生產(chǎn)上的重要問題[29]。根腐平臍蠕孢致病的分子機(jī)制研究腐平臍蠕孢能侵染寄主植物的根、莖、葉、穗和籽粒等多個(gè)部位[30,31]。-2 中，分生孢子分泌粘液，粘附在小麥穗部內(nèi)表面，并從分生孢子的兩，，芽管延伸并產(chǎn)生多重分支，分支頂端分化出附著胞的侵染結(jié)構(gòu)，大量侵染釘直接穿透寄主表面角質(zhì)層，侵入菌絲在寄主細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間延長從氣孔等自然孔口侵染的現(xiàn)象[32]。為進(jìn)一步了解麥根腐平臍蠕孢侵染禾制，建立了二倍體短柄草—根腐平臍蠕孢病原菌的互作模型，麥根腐平的相互作用研究為探討與六倍體小麥互作提供了方便的互作模式[33]。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.121.47

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2615358