【摘要】：目的:三萜皂苷是一類具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物,是多種藥用植物的主要藥效活性物質(zhì),但是分離困難和人工合成步驟多、收率低等問(wèn)題限制了這類成分的獲取和開(kāi)發(fā)利用,因此研究其微生物異源合成具有重要意義。我國(guó)南方常用中藥毛冬青(Ilex ubescens)含有多種熊果烷型三萜皂苷類活性成分,后者共同的結(jié)構(gòu)特征是C-28位甲基被氧化形成羧基。因此,本研究的目的是從毛冬青轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘與毛冬青三萜皂苷C-28位氧化修飾相關(guān)的關(guān)鍵酶——細(xì)胞色素P450單加氧酶(CYP)基因,并進(jìn)行功能鑒定,為后續(xù)開(kāi)展活性毛冬青三萜皂苷的微生物異源合成奠定基礎(chǔ)。方法:1、CYPs候選基因的篩選以10個(gè)已鑒定的催化三萜C-28位氧化的CYPs作為比對(duì)分析對(duì)象,對(duì)毛冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行本地BLAST分析,篩選同源性大于40%的CYPs候選基因;將候選出的CYPs和已知CYPs進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析,根據(jù)遺傳進(jìn)化關(guān)系,從中篩選出可信度最高的C-28位三萜氧化酶候選基因。2、候選基因克隆和載體構(gòu)建從毛冬青嫩葉中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄制備cDNA,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得候選基因。用In-FusionTM連接技術(shù)將候選基因及毛冬青三萜合酶基因IpAS1(課題組前期已獲得)連接至同一酵母表達(dá)載體pJL的兩個(gè)不同表達(dá)盒,獲得帶目的基因的酵母重組質(zhì)粒。3、候選基因編碼蛋白的表達(dá)與功能分析應(yīng)用醋酸鋰轉(zhuǎn)染方法,將攜帶目的基因的酵母重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到可以特異性表達(dá)擬南芥細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)的釀酒酵母菌株S.cerevisiae WAT1l中,然后用2%半乳糖來(lái)誘導(dǎo)候選基因的表達(dá),用Western Blot實(shí)驗(yàn)分析蛋白表達(dá)情況,用GC-MS檢測(cè)代謝產(chǎn)物熊果酸和齊墩果酸。4、密碼子優(yōu)化與過(guò)表達(dá)tHMGR調(diào)控重組酵母中齊墩果酸和熊果酸的合成根據(jù)釀酒酵母對(duì)密碼子的偏好性,優(yōu)化目的基因密碼子,同理構(gòu)建酵母重組質(zhì)粒,考察密碼子優(yōu)化對(duì)重組酵母合成熊果酸產(chǎn)率的影響。另一方面,通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化將萜烯生物合成途徑中的主要限速酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)引入重組酵母,增加釀酒酵母HMGR基因拷貝數(shù),用GC-MS檢測(cè)代謝產(chǎn)物熊果酸,并與相應(yīng)的HMG整合進(jìn)基因組的重組酵母、以及未轉(zhuǎn)化HMGR的重組酵母進(jìn)行比較。成果:1、毛冬青三萜C-28位氧化相關(guān)CYP候選基因通過(guò)序列分析,從毛冬青轉(zhuǎn)錄組中找到1個(gè)可能參與到毛冬青三萜的C-28位氧化的CYP基因(命名為IpAO1),該候選基因包含一個(gè)1437 bp的開(kāi)放閱讀框,可能編碼一個(gè)478 aa的蛋白,催化熊果烷或齊墩果烷C-28位的氧化,生成相應(yīng)的熊果酸和齊墩果酸。2、IpAO1 功能將帶有IpAO1和IpAS1雙基因的釀酒酵母重組質(zhì)粒pJL-AS1+AO1轉(zhuǎn)化至酵母菌株WAT11。Western Blot結(jié)果表明,在2%半乳糖誘導(dǎo)下,重組酵母WAT11-pJL-AS1+AO1能夠表達(dá)與預(yù)期大小相符的IpAS1蛋白和IpAO1蛋白。GC-MS分析結(jié)果顯示,僅表達(dá)IpAS1基因的重組酵母產(chǎn)生了熊果烷和齊墩果烷,而共表達(dá)IpAS1和IpAO1基因的重組酵母合成了熊果酸和齊墩果酸。因此,IpAO1編碼一個(gè)熊果烷及齊墩果烷的C-28位氧化酶。3、密碼子優(yōu)化與過(guò)表達(dá)tHMGR提高重組酵母合成熊果酸的產(chǎn)率應(yīng)用密碼子優(yōu)化技術(shù),獲得密碼子優(yōu)化后的IpAS1基因(命名為opIpAS1)和IpAO1基因(命名為opIpA01),轉(zhuǎn)化釀酒酵母WAT11,獲得重組酵母WAT11-pJL-opAS1+opAO1。GC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示,密碼子優(yōu)化后,重組酵母生成熊果酸的產(chǎn)率提高了 3.84倍。將質(zhì)粒pJL-tHMGR轉(zhuǎn)化重組酵母WAT11-pJL-AS1+AO1,獲得重組酵母WAT11-pJL-AS1+AO1/pJL-tHMGR。同時(shí),將質(zhì)粒 pJL-AS1+AO1 轉(zhuǎn)化酵母 WAT11-T(WAT11,trp1::PGAP1-SctHMGR1-TCYC1,Cas9-NAT),獲得重組酵母WAT11-T-pJL-AS1+AO1。GC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示,與重組菌株WAT11-pJL-AS1+AO1相比,增加了tHMG 基因拷貝數(shù)的兩個(gè)新的重組酵母的熊果酸產(chǎn)率,分別提高了 2.07倍和3.36 倍。結(jié)論:本研究成功鑒定了一個(gè)毛冬青三萜C-28位氧化酶基因IpAO1,它能夠催化熊果烷和齊墩果烷生成相應(yīng)的熊果酸和齊墩果酸。密碼子優(yōu)化技術(shù)和過(guò)表達(dá)酵母體內(nèi)MVA途徑的tHMGR基因都有利于重組酵母生成熊果酸和齊墩果酸。
【圖文】：

三菇皂昔母核形成相關(guān)的環(huán)化反應(yīng)

ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ，邋ＣＹＰ４５０，簡(jiǎn)稱邋ＣＹＰｓ）氧化、糖基轉(zhuǎn)移酶（Ｕｒｉｄｉｎｅ邋５＇－ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ－逡逑ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＵＧＴｓ）的糖基化等后修飾過(guò)程，，最終形成種類眾多的單體逡逑皂苷［１８］，如圖２所示。逡逑３逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.19

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄭夏生;羅秀秀;徐暉;詹若挺;陳蔚文;;崗梅轉(zhuǎn)錄組及其烏索烷型三萜皂苷生物合成相關(guān)酶基因的發(fā)掘[J];世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化;2014年07期

2 張立春;劉曉輝;曹陽(yáng);于永生;樸慶林;金海國(guó);王曉陽(yáng);;線蟲Fat-1基因密碼子的優(yōu)化及其真核表達(dá)載體構(gòu)建[J];生物技術(shù)通訊;2012年03期

3 岳桂東;高強(qiáng);羅龍海;王軍一;許姣卉;尹燁;;高通量測(cè)序技術(shù)在動(dòng)植物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2012年02期

4 熊綿靖;唐其;馬小軍;;羅漢果三萜皂苷生物合成規(guī)律研究探討[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2011年05期

5 鄭關(guān)毅;石旺清;陳曉東;朱元貴;張靜;江瓊;;毛冬青甲素對(duì)大鼠腦缺血再灌注后bFGF、GAP-43的表達(dá)及神經(jīng)元再生的影響[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2011年09期

6 李向榮;;毛冬青藥理作用研究概述[J];環(huán)球中醫(yī)藥;2011年03期

7 焦曉林;高微微;;環(huán)境因子對(duì)藥用植物三萜皂苷合成影響的研究進(jìn)展[J];中草藥;2011年02期

8 賀麗虹;趙淑娟;胡之璧;;植物細(xì)胞色素P450基因與功能研究進(jìn)展[J];藥物生物技術(shù);2008年02期

9 陶令霞;夏鐵騎;�；燮�;;兩種測(cè)定固氮菌NT06菌株生長(zhǎng)曲線方法的比較[J];生物學(xué)雜志;2007年05期

10 黃瑛;曾慶平;;萜類生物合成的基因操作[J];中國(guó)生物工程雜志;2006年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 蒙海林;基于系統(tǒng)—合成生物學(xué)的天然產(chǎn)物異源生物合成研究[D];華南理工大學(xué);2011年

2 孫明謙;中藥復(fù)雜成分樣品的電噴霧質(zhì)譜分析方法研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 溫羚玲;毛冬青中烏蘇烷型三萜皂苷生物合成相關(guān)基因的發(fā)掘[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

2 張楠;紫杉烷9α-羥基化酶基因的克隆與功能分析[D];中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院;2013年

本文編號(hào)：2615233