【摘要】：目的:干擾素(Interferons)是一種具有多功能活性的蛋白質(zhì),是當機體和細胞受到病毒或其它誘導劑刺激后,由淋巴細胞和單核細胞產(chǎn)生的一種細胞因子,能夠誘導脊椎動物進入抗病毒狀態(tài)。除了抗病毒作用外,它還參與其它重要的生理過程,如調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、凋亡以及機體免疫反應等。魚類是低等脊椎動物,非特異性免疫占有重要地位。IFN系統(tǒng)作為一種高效的非特異性免疫因子,在魚體的抗感染免疫中發(fā)揮重要的作用。翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)是中國重要的名優(yōu)淡水養(yǎng)殖品種,隨著養(yǎng)殖密度的提高,養(yǎng)殖病害愈發(fā)嚴重,由ISKNV引起的傳染性脾腎壞死病的暴發(fā),不僅帶來巨大經(jīng)濟損失,還制約翹嘴鱖養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本研究旨在通過克隆翹嘴鱖IFN-α3基因,分析IFN-α3的表達模式,構建IFN-α3的原核表達載體,誘導表達出重組蛋白,制備特異性多克隆抗體,揭示經(jīng)Poly I:C刺激后翹嘴鱖體內(nèi)IFN-α3基因、IFN-α3蛋白的表達情況,為IFN-α3的功能研究奠定基礎,對于魚類病毒性疾病的防治研究具有重要的理論和實際意義。方法:運用RACE技術從翹嘴鱖中克隆IFN-α3全長c DNA,通過q PCR檢測健康翹嘴鱖以及聚肌胞甘酸(Poly I:C)刺激下翹嘴鱖各組織中IFN-α3的相對表達量,采用p ET32a(+)原核表達系統(tǒng)表達IFN-α3重組蛋白,以割膠純化的翹嘴鱖IFN-α3重組蛋白為免疫原,并以腹腔與皮下組織交替注射的方法免疫小鼠,制備抗翹嘴鱖IFN-α3的多克隆抗體。采用瓊脂雙擴散法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術檢測抗體的效價,用免疫印跡(Western blot)技術檢測抗體的特異性,最后運用Western blot分析聚肌胞甘酸(Poly I:C)刺激后翹嘴鱖各免疫相關組織中天然IFN-α3蛋白的表達特征。結果:翹嘴鱖IFN-α3 c DNA全長為863bp,包含一個537 bp的開放閱讀框,編碼長度為178個氨基酸的多肽,去除信號肽后,預測的分子量為18 k Da,氨基酸序列具有IFN-α3家族特征性序列。系統(tǒng)進化樹分析結果顯示,翹嘴鱖和其它鱸科魚類的IFN-α3歸為單獨的一支。健康翹嘴鱖胸腺、頭腎、鰓、脾臟、肝臟、腸、體腎、血共8種組織中IFN-α3 m RNA均有不同水平的表達,血、頭腎、脾臟、胸腺中其轉(zhuǎn)錄水平相較其它組織高,經(jīng)Poly I:C刺激魚體后,IFN-α3轉(zhuǎn)錄水平在胸腺、頭腎、脾臟、肝臟、體腎、血中顯著上調(diào);其中,肝臟在Poly I:C刺激3 h后IFN-α3上調(diào)達最高峰,胸腺于Poly I:C刺激后6h時表達量最高,頭腎、脾臟分別在12 h、48 h時達最高峰。表達菌經(jīng)IPTG誘導,表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測,結果顯示重組蛋白大小為36 k Da,與預測大小相符。瓊脂雙擴散顯示,所獲多抗的效價為1:32,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)結果顯示,翹嘴鱖IFN-α3多克隆抗體效價可達1∶64000;Western blot結果顯示,所制備的多克隆抗體可特異性識別原核表達的IFN-α3重組蛋白和翹嘴鱖體內(nèi)天然IFN-α3蛋白。結論:我們克隆并鑒定了翹嘴鱖IFN-α3基因,分析了健康以及Poly I:C刺激下翹嘴鱖各組織中IFN-α3的表達模式,誘導表達出重組蛋白,制備并驗證了抗翹嘴鱖IFN-α3多克隆抗體,該研究證實,經(jīng)Poly I:C刺激后,翹嘴鱖體內(nèi)表達出了IFN-α3蛋白。本研究為蛋白的原核表達和特異性多抗的制備及驗證提供了研究思路,也為研究翹嘴鱖IFN-α3基因功能提供了特異性抗體,同時為魚類IFN在魚類病害防治上的開發(fā)和利用奠定了基礎。
【圖文】：

二聚化并且結合 IRF-9，激活 ISG 基因啟動子上的 IFN 刺激反應元件(ISRE)。最后，，ISG 基因開始轉(zhuǎn)錄，從而使 IFN 鄰近的細胞合成抗病毒蛋白。圖-1 哺乳動物 IFN 信號通路（JAK-STAT 通路）圖-2 IFN-α/β抗病毒作用的 2 步信號傳導途徑圖

IFN-α/β抗病毒作用的2步信號傳導途徑圖
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

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本文編號：2615112