【摘要】：目的:干擾素(Interferons)是一種具有多功能活性的蛋白質(zhì),是當(dāng)機體和細(xì)胞受到病毒或其它誘導(dǎo)劑刺激后,由淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子,能夠誘導(dǎo)脊椎動物進(jìn)入抗病毒狀態(tài)。除了抗病毒作用外,它還參與其它重要的生理過程,如調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及機體免疫反應(yīng)等。魚類是低等脊椎動物,非特異性免疫占有重要地位。IFN系統(tǒng)作為一種高效的非特異性免疫因子,在魚體的抗感染免疫中發(fā)揮重要的作用。翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)是中國重要的名優(yōu)淡水養(yǎng)殖品種,隨著養(yǎng)殖密度的提高,養(yǎng)殖病害愈發(fā)嚴(yán)重,由ISKNV引起的傳染性脾腎壞死病的暴發(fā),不僅帶來巨大經(jīng)濟損失,還制約翹嘴鱖養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本研究旨在通過克隆翹嘴鱖IFN-α3基因,分析IFN-α3的表達(dá)模式,構(gòu)建IFN-α3的原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白,制備特異性多克隆抗體,揭示經(jīng)Poly I:C刺激后翹嘴鱖體內(nèi)IFN-α3基因、IFN-α3蛋白的表達(dá)情況,為IFN-α3的功能研究奠定基礎(chǔ),對于魚類病毒性疾病的防治研究具有重要的理論和實際意義。方法:運用RACE技術(shù)從翹嘴鱖中克隆IFN-α3全長c DNA,通過q PCR檢測健康翹嘴鱖以及聚肌胞甘酸(Poly I:C)刺激下翹嘴鱖各組織中IFN-α3的相對表達(dá)量,采用p ET32a(+)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IFN-α3重組蛋白,以割膠純化的翹嘴鱖IFN-α3重組蛋白為免疫原,并以腹腔與皮下組織交替注射的方法免疫小鼠,制備抗翹嘴鱖IFN-α3的多克隆抗體。采用瓊脂雙擴散法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術(shù)檢測抗體的效價,用免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測抗體的特異性,最后運用Western blot分析聚肌胞甘酸(Poly I:C)刺激后翹嘴鱖各免疫相關(guān)組織中天然IFN-α3蛋白的表達(dá)特征。結(jié)果:翹嘴鱖IFN-α3 c DNA全長為863bp,包含一個537 bp的開放閱讀框,編碼長度為178個氨基酸的多肽,去除信號肽后,預(yù)測的分子量為18 k Da,氨基酸序列具有IFN-α3家族特征性序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,翹嘴鱖和其它鱸科魚類的IFN-α3歸為單獨的一支。健康翹嘴鱖胸腺、頭腎、鰓、脾臟、肝臟、腸、體腎、血共8種組織中IFN-α3 m RNA均有不同水平的表達(dá),血、頭腎、脾臟、胸腺中其轉(zhuǎn)錄水平相較其它組織高,經(jīng)Poly I:C刺激魚體后,IFN-α3轉(zhuǎn)錄水平在胸腺、頭腎、脾臟、肝臟、體腎、血中顯著上調(diào);其中,肝臟在Poly I:C刺激3 h后IFN-α3上調(diào)達(dá)最高峰,胸腺于Poly I:C刺激后6h時表達(dá)量最高,頭腎、脾臟分別在12 h、48 h時達(dá)最高峰。表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測,結(jié)果顯示重組蛋白大小為36 k Da,與預(yù)測大小相符。瓊脂雙擴散顯示,所獲多抗的效價為1:32,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)結(jié)果顯示,翹嘴鱖IFN-α3多克隆抗體效價可達(dá)1∶64000;Western blot結(jié)果顯示,所制備的多克隆抗體可特異性識別原核表達(dá)的IFN-α3重組蛋白和翹嘴鱖體內(nèi)天然IFN-α3蛋白。結(jié)論:我們克隆并鑒定了翹嘴鱖IFN-α3基因,分析了健康以及Poly I:C刺激下翹嘴鱖各組織中IFN-α3的表達(dá)模式,誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白,制備并驗證了抗翹嘴鱖IFN-α3多克隆抗體,該研究證實,經(jīng)Poly I:C刺激后,翹嘴鱖體內(nèi)表達(dá)出了IFN-α3蛋白。本研究為蛋白的原核表達(dá)和特異性多抗的制備及驗證提供了研究思路,也為研究翹嘴鱖IFN-α3基因功能提供了特異性抗體,同時為魚類IFN在魚類病害防治上的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

二聚化并且結(jié)合 IRF-9，激活 ISG 基因啟動子上的 IFN 刺激反應(yīng)元件(ISRE)。最后，，ISG 基因開始轉(zhuǎn)錄，從而使 IFN 鄰近的細(xì)胞合成抗病毒蛋白。圖-1 哺乳動物 IFN 信號通路（JAK-STAT 通路）圖-2 IFN-α/β抗病毒作用的 2 步信號傳導(dǎo)途徑圖

IFN-α/β抗病毒作用的2步信號傳導(dǎo)途徑圖
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

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本文編號：2615112