發(fā)布時間：2020-04-04 23:20

【摘要】：理想的植物株型塑造有利于提高作物產(chǎn)量,人們通過果樹剪枝提高坐果率,通過增加水稻和小麥的分蘗數(shù)來提高產(chǎn)量。植物地上部分的形態(tài)主要由植物的分枝發(fā)育決定,植物的分枝發(fā)育主要經(jīng)歷三個階段:首先是側(cè)分生組織的起始,主要受遺傳因子的調(diào)控;然后是腋芽的形成和腋芽的生長與休眠,主要由植物的發(fā)育進程、外界環(huán)境和一些植物激素(如生長素、細胞分裂素、獨腳金內(nèi)酯等)共同決定。煙草是一種以收獲葉為生產(chǎn)原料的經(jīng)濟作物,它的株型單一,分枝方式為單軸分枝。在煙草的營養(yǎng)生長階段,受頂端優(yōu)勢的抑制,其腋芽并不生長。當(dāng)煙草由營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L階段時,頂端優(yōu)勢減弱,且在煙草的實際生產(chǎn)中要對其進行打頂。煙草打頂后,頂端優(yōu)勢解除導(dǎo)致葉腋生長素濃度降低,而細胞分裂素濃度升高,促進了腋芽的生長,形成新的分枝。腋芽的生長不利于老葉營養(yǎng)物質(zhì)的積累,會降低煙葉的商業(yè)價值,所以要對其進行抹芽。煙草的打頂抹芽是一項費時耗力的工作,基于此本研究希望通過CRISPR/Cas9基因編輯的方法對煙草側(cè)分生組織形成的相關(guān)基因(las,bl,rev)進行敲除,以期獲得打頂后腋芽減少生長的突變體,并進行相應(yīng)的基因功能研究,對以后培育打頂后可自行抑芽的煙草品種提供理論基礎(chǔ)。主要獲得的研究結(jié)果如下:1.通過同源比對和蛋白功能域分析從煙草基因組中鑒定到9個HD-Zip Ⅲ轉(zhuǎn)錄因子家族成員,分別命名為NtHB1～NtHB9,其中NtHB6和NtHB9與rev的同源性最高,分別為79.88%和80.24%。通過同源比對和進化分析,從煙草基因組中鑒定到兩個las的同源基因Ntlas1和Ntlas2。從NCBI上下載了煙草中bl的同源基因Ntrax1和Ntrax2。設(shè)計引物克隆了NtHB6/NtHB9,Ntlas1/Ntlas 和Ntrax1/Ntrax2的CDS序列并進行序列分析。2.根據(jù)目標基因的基因結(jié)構(gòu)和CDS序列,每個基因設(shè)計了 3個編輯的靶位點,其中rev的第一個和第三個靶位點為NtHB9上的序列,第二個靶位點為NtHB6/NtHB9的共同序列;構(gòu)建了單基因敲除載體和雙基因敲除載體共計12個;通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法侵染野生型煙草紅花大金元葉片,經(jīng)歷愈傷誘導(dǎo)后獲得再生植株;再生植株靶位點突變檢測結(jié)果顯示每個基因都成功獲得了突變體,突變形式為堿基的刪除、插入和替換,套袋自交獲得T1代突變體。3.成功獲得單基因敲除突變株7株,雙基因敲除突變株5株。我們對其中的一些突變體進行了分析,突變位點分析結(jié)果顯示:rev2-4和rev2-6都檢測到了NtHB6/NtHB9雙基因突變,堿基的刪除和插入導(dǎo)致基因編碼提前終止,蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測其不能形成MEKHLA結(jié)構(gòu)域,而這個結(jié)構(gòu)域是rev所屬亞家族特有的結(jié)構(gòu)域,它在蛋白二聚化過程中具有很重要的作用;rev1-3檢測到了NtHB 單基因突變,堿基的刪除使得氨基酸序列第34和35位出現(xiàn)氨基酸的刪除和替換,蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測并未對蛋白編碼產(chǎn)生較大影響;las2-1為單基因突變體,其堿基的刪除導(dǎo)致基因編碼提前終止。4.在獲得的T1代突變體中,rev2-6突變表型明顯,其純合突變體頂芽發(fā)育缺陷,停留在兩片子葉的發(fā)育狀態(tài),或頂端發(fā)育出數(shù)量不一的異形葉。異形葉的形狀一般為圓形、喇叭狀、不對稱扇形,葉脈發(fā)育不完全。頂芽發(fā)育缺陷的突變株根基本不發(fā)育,頂端發(fā)育出異形葉的突變株能發(fā)育出少量根。Rev1-3的純合突變體正常生長,且在打頂10天、20天、30天后腋芽生長數(shù)目較野生型并沒有很大差異。Rev2-4均為雜合體,正常生長,但在打頂10天、20天、30天后腋芽的平均生長數(shù)目均低于野生型。5.通過突變體rev2-6的研究,對NtHB6/NtHB9影響煙草發(fā)育的多效性進行了分析。其影響包括以下幾個方面:①對頂端分生組織的影響,頂芽發(fā)育缺陷,頂端分生組織發(fā)育相關(guān)基因表達量變化顯著。②對非頂端分生組織的影響,異型葉表面生長出凸起的組織或葉狀體,葉片厚度明顯增加,單位葉面積重量增加。通過掃描電鏡對突變體葉表面進行觀察,發(fā)現(xiàn)葉片腺毛數(shù)量明顯減少,表皮細胞明顯增大。③對葉片發(fā)育的影響包括3個方面:首先是葉片不能建立正常的葉極性,發(fā)育出異形葉,且和葉片極性建立相關(guān)的基因表達量變化顯著;其次是不能發(fā)育出完整的葉脈,葉脈維管束變小;最后葉片的代謝物質(zhì)總糖、總蛋白、葉綠素、類胡蘿卜素含量降低。
【圖文】：

長主要是莖和側(cè)枝的發(fā)育，莖由胚胎發(fā)育時期產(chǎn)生的頂端分生組織一直維持植株逡逑的向上生長而來，側(cè)枝則由側(cè)分生組織發(fā)育形成［５］。逡逑植物分枝起源于側(cè)分生組織，其發(fā)育進程主要包括三個階段（圖１．２）：側(cè)分逡逑生組織（ＡＭ）的起始，，腋芽的形成以及腋芽的生長與休眠［６］。側(cè)分生組織的形成逡逑主要受一些遺傳因子的調(diào)控，這些基因通過調(diào)控一系列和頂端分生組織以及側(cè)分逡逑生組織形成相關(guān)基因的時空表達，來調(diào)控側(cè)分生組織的起始。一般認為側(cè)分生組逡逑織的起源有兩種模式：一種模式認為它們源自葉原基，以及從頂端分生組織分離逡逑出來的具有分生特性的細胞。例如，番茄的兄（＆）突變體逡逑中，營養(yǎng)生長階段腋芽發(fā)育缺陷，這是因為葉原基離開頂端時，其基部沒有具有逡逑分生特性的細胞群不能形成分生組織［７］。另一種模式則認為腋生分生組織和頂端逡逑分生組織是獨立存在的，發(fā)育中的葉基部細胞開始分化，在原基從頂端分生組織逡逑分離后

植物莖頂端分生組織（ＳＡＭ）是產(chǎn)生植物地上部分所有器官的源泉，包括葉、逡逑莖、側(cè)枝、花序等頂端分生組織根據(jù)細胞分裂方向分為３層，即Ｌ１－Ｌ３，后期逡逑發(fā)育為不同的組織；根據(jù)位置和功能分為三個區(qū)域（圖１．４），中心區(qū)（０Ｃ）由逡逑千細胞和組織中心組成，周邊區(qū)（ＰＺ）分化成側(cè)器官，肋狀區(qū)（ＲＺ）位于組織中逡逑心下方，為莖的生長提供細胞［１７］。中心區(qū)千細胞衍生的細胞轉(zhuǎn)換成周邊區(qū)細胞，逡逑形成側(cè)器官原基，進行器官的分化，而內(nèi)周邊區(qū)的細胞可以通過脫分化恢復(fù)到干逡逑細胞狀態(tài)［１８］。盡管壟頂端分生組織的細胞處于不斷分裂、分化的狀態(tài)，但各個Ｋ逡逑域的細胞數(shù)目卻保持著相對恒定的比例，維持著莖頂端的生長，這一過程需要細逡逑胞中各種基因表達的調(diào)控，同時形成一個維持穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［１９，２＇逡逑４逡逑
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S572

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2614195