【摘要】：果膠甲酯酶(PME)廣泛存在于細(xì)菌、真菌以及高等植物中,可以催化甲酯化的果膠產(chǎn)生去酯化作用,果膠甲酯酶抑制劑(PMEI)能夠特異性的抑制植物中PME的脫酯化作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),PMEI可能參與人參皂苷合成的調(diào)節(jié),但是相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。胡蘿卜與人參親緣關(guān)系較近,培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單。類胡蘿卜素與人參皂苷的合成都是以異戊烯基焦磷酸(IPP)作為前體,且植物干細(xì)胞具有旺盛的分裂能力和較高的遺傳穩(wěn)定性,能維持穩(wěn)定的增殖速度。所以可以利用胡蘿卜干細(xì)胞為受體材料,研究人參皂苷合成相關(guān)基因的功能。鑒于以上基礎(chǔ),本研究以吉林人參248,993 Unigenes數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ),從中篩選出吉林人參PgPMEIs。在系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上,根據(jù)分析結(jié)果從中選擇1條吉林人參PgPMEI基因序列克隆目的基因并構(gòu)建表達(dá)載體,以胡蘿卜干細(xì)胞為受體,進(jìn)行異源受體的轉(zhuǎn)化,從而研究目的基因的功能。取得的結(jié)果如下:1.從吉林人參14個(gè)組織器官248,993轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出12條PgPMEIs。GO注釋結(jié)果顯示,在Level-2水平下,分別注釋到分子功能調(diào)節(jié)劑和生物調(diào)節(jié)方面。富集分析顯示,在生物調(diào)節(jié)方面具有極顯著差異。2.PgPMEIs與外源物種系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,PgPMEIs在進(jìn)化上晚于胡蘿卜,且具有良好的保守性;3.12條PgPMEIs氨基酸序列比對(duì)以及保守motif預(yù)測(cè)結(jié)果表明,PgPMEIs含有4個(gè)保守的Cys,和一段保守的SNAL氨基酸區(qū)段;4.PgPMEIs與皂苷生物合成關(guān)鍵酶基因之間的互作關(guān)系說(shuō)明基因不是獨(dú)立存在,而是以集群的形式存在,相互協(xié)作,形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),共同參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。并且在12條PgPMEIs中,PgPMEI09與各基因之間互作關(guān)系最緊密,連線數(shù)為8條;5.表達(dá)模式分析表明,PgPMEIs在人參中的表達(dá)不受農(nóng)家品種的影響。4個(gè)年生根中PgPMEIs的表達(dá)隨著參齡的增加而增加。14個(gè)組織部位中PgPMEIs表達(dá)模式表明,果莖中表達(dá)的基因最多,為11條,莖中表達(dá)的基因最少,為6條。12條PgPMEIs中有4條基因在14個(gè)組織器官都參與表達(dá),其分別為PgPMEI02、PgPMEI09、PgPMEI11和PgPMEI12;6.在上述分析結(jié)果的基礎(chǔ)上,篩選出PgPMEI09,克隆了該基因并構(gòu)建了表達(dá)載體;7.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥,觀察T_2代擬南芥和野生型擬南芥。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)后擬南芥抽苔時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間都比野生型延后,轉(zhuǎn)化后擬南芥果莢長(zhǎng)度以及每個(gè)果莢的籽粒數(shù)都降低,種子的千粒重?zé)o顯著變化,與野生型擬南芥相比轉(zhuǎn)化后擬南芥植株P(guān)ME活性降低;8.成功誘導(dǎo)胡蘿卜根形成層干細(xì)胞系并建立了再生體系。結(jié)果表明:WPM+IBA4mg/L培養(yǎng)基對(duì)胡蘿卜干細(xì)胞的誘導(dǎo)效果最好,誘導(dǎo)率為91.33%;MS+2,4-D 2 mg/L+IBA0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L培養(yǎng)基的增殖效果最好;干細(xì)胞接種于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基,在25℃條件下,16 h光照、8 h黑暗交替培養(yǎng),再生率為95.5%,愈傷組織的再生率為89.25%。生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明,干細(xì)胞的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、類胡蘿卜素含量以及過(guò)氧化物酶(POD)活性均高于愈傷組織細(xì)胞;9.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化胡蘿卜干細(xì)胞和愈傷組織,干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率為39.64%,愈傷組織的轉(zhuǎn)化率為31.29%。對(duì)轉(zhuǎn)化后的胡蘿卜干細(xì)胞和愈傷組織的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、PME活性以及過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)化前相比,可溶性糖含量、可溶性蛋白含量以及PME活性均有不同程度的降低,而POD活性升高。本研究為進(jìn)一步開(kāi)展人參功能基因的研究提供了參考。
【圖文】：

2.2.3.3 擬南芥陽(yáng)性植株的檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)化后的 T2代擬南芥進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。設(shè)計(jì) 3 對(duì)引物，針對(duì)目的基因開(kāi)放閱讀框內(nèi)中間序列設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為 A 片段；針對(duì) 35S 啟動(dòng)子與目的基因連接處設(shè)計(jì)上游引物與 A 片段的下游引物進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為 片段；針對(duì) GUS 基因與目的基因連接處設(shè)計(jì)下游引物與 A 片段上游引物進(jìn)行 PCR 檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物命名為 C 片段。引物設(shè)計(jì)如表 2-15 所示，A、B、C 片段如圖 2.1 所示。

到的 GO Term 進(jìn)行富集分析。3.1.2.1 吉林人參 PgPMEIs 物種注釋分析吉林人參12條PgPMEIs序列注釋到的信息在不同物種中的分布如圖3.1。其中包括：胡蘿卜（Daucus carota subsp. Sativus）、樟子松（Olea europaea var. sylvestris）煙草（Nicotiana tabacum）、芝麻（Sesamum indicum）、美花煙草（Nicotiana sylvestris）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、野生煙草（Nicotiana attenuata）、紫花風(fēng)鈴木（Handroanthusimpetiginosus）、栓皮櫟（Quercus suber）、黃燈籠辣椒（Capsicum chinense）、中粒咖啡（Coffea canephora）、毛果楊（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis vinifera）、燈籠辣椒（Capsicum baccatum）、番茄（Solanum lycopersicum）、猴面花（Mimulus guttatus）、茸毛煙草（Nicotiana tomentosiformis）、甜椒（Capsicum annuum）、野生種潘那利番茄（Solanum pennellii）等。其中在胡蘿卜中注釋到的序列條目最多為 27 條，占總條目的10.5%；其次為樟子松為 14 條，占總條目的 5.5%。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.51

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡博華;徐R

本文編號(hào)：2614129