【摘要】：棉花是世界上重要的經(jīng)濟作物,也是我國十大油料作物之一。中國雖是產(chǎn)棉大國,但棉籽加工仍然存在加工規(guī)模小和技術(shù)落后的問題。棉籽油作為一種清潔的可再生能源,是良好的生物柴油原料。因此,在不影響棉花產(chǎn)質(zhì)量的前提下,提高棉籽油的含量,改善棉籽油脂肪酸組分成為棉花育種新的切入點。此外,棉纖維品質(zhì)單一和低下已成為棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸,提升棉纖維質(zhì)量迫在眉睫。AKR2A(ankyrin repeat-contain protein 2A)是一個高效伴侶蛋白,研究發(fā)現(xiàn),AKR2A與KCS1存在互作關(guān)系,能夠調(diào)控超長鏈脂肪酸(Very-long-chain fatty acids,VLCFAs)合成,從而提高棉籽油含油量和脂肪酸組成,而VLCFA是調(diào)控棉纖維發(fā)育的一條重要途徑,并能提高棉纖維長度。本文利用基因工程技術(shù)將擬南芥AKR2A基因轉(zhuǎn)入棉花中,最終獲得高表達棉花轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)KR2A-2,AKR2A-57;分析轉(zhuǎn)基因棉花植株的農(nóng)藝學(xué)性狀,并對轉(zhuǎn)基因棉花種子進行含油量、脂肪酸組分分析以及脂肪酸合成相關(guān)基因表達量分析;利用酵母雙雜交和模式植物擬南芥篩選AKR2A互作蛋白KCS1;同時分析AKR2A、KCS1單基因過表達植株和雙基因過表達植株含油量、脂肪酸組分變化和脂肪酸合成相關(guān)基因表達量變化。主要結(jié)果如下。1.利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染棉花下胚軸,將擬南芥AKR2A基因轉(zhuǎn)入棉花,離體培養(yǎng)獲得再生植株。通過PCR鑒定、實時熒光定量PCR鑒定和Western blot鑒定,最終獲得高表達棉花轉(zhuǎn)基因純系A(chǔ)KR2A-2和AKR2A-57。2.利用索氏提取法分析轉(zhuǎn)基因棉花植株AKR2A-2和AKR2A-57種子不同發(fā)育時期含油量,發(fā)現(xiàn)20-30 d棉花開花發(fā)育時期是種子油含量的快速增長期,以野生型棉花為對照,從25 d開始,轉(zhuǎn)基因棉花種子含油量顯著高于野生型植株,30 d時,轉(zhuǎn)基因植株含油量比野生型提高33%,轉(zhuǎn)基因棉花植株AKR2A-2和AKR2A-57成熟種子含油量分別比野生型提高8.40%和11.19%。通過比較成熟種子油脂色澤發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因棉花植株成熟種子油脂色澤較野生型深。3.利用氣相色譜分析棉花種子不同發(fā)育時期脂肪酸組分的變化,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株VLCFA含量在各時期均高于野生型,15 d時,轉(zhuǎn)基因植株比對照提高近一倍,超長鏈與長鏈脂肪酸比例也有相同趨勢。4.利用實時熒光定量PCR分析脂肪酸合成相關(guān)基因表達量在棉花種子不同發(fā)育時期的差異發(fā)現(xiàn),與野生型相比,轉(zhuǎn)基因棉花植株種子脂肪酸合成相關(guān)基因表達量在各個階段都有不同程度的提高,15-20 d時各基因表達量達到最高。ECR1基因在15-20 d種子中表達趨勢上升明顯,最高時達到對照Coker的1.3倍左右,FAD2-1基因在種子的發(fā)育過程中基因表達量顯著提高,且在AKR2A轉(zhuǎn)基因植株中一直保持高表達狀態(tài)。5.分析轉(zhuǎn)基因棉花的農(nóng)藝學(xué)性狀發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因棉花植株的棉纖維和棉籽產(chǎn)量顯著高于野生型。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因棉花發(fā)育各個時期,棉纖維長度都有不同程度的提高,棉纖維發(fā)育15d時,AKR2A轉(zhuǎn)基因棉花的棉纖維長度比對照Coker提高最多,達5 mm左右。6.通過酵母雙雜交篩選到AKR2A互作的擬南芥蛋白KCS1,通過免疫共沉淀驗證了 AKR2A與KCS1在擬南芥體內(nèi)的真實互作關(guān)系。7.利用實時熒光定量PCR分析AKR2A基因過表達擬南芥植株中部分KCS家族基因的表達量發(fā)現(xiàn),與野生型植株Col-0相比,AKR2A單基因過表達植株的KCS家族基因表達量上調(diào);分析AKR2A、KCS1單基因過表達擬南芥植株和雙基因過表達擬南芥植株種子含油量發(fā)現(xiàn),三種轉(zhuǎn)基因擬南芥植株種子含油量均不同程度高于野生型;分析AKR2A、KCS1雙基因過表達擬南芥植株脂肪酸組分變化發(fā)現(xiàn),雙基因過量表達植株種子的VLCFA含量比野生型提高24.7%,占總脂肪酸比例提高25.97%。
【圖文】：

ＡＫＲ２Ａ蛋白包含四個在Ｃ端的亮氨酸重復(fù)序列，和一個Ｎ端的ＰＥＳＴ區(qū)域［２９］，逡逑該ＰＥＳＴ結(jié)構(gòu)域序列為一富含脯氨酸（Ｐ）、谷氨酰胺（Ｅ）、絲氨酸（Ｓ）、蘇氦酸（Ｔ）逡逑的約１０個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)序列，ＡＫＲ２Ａ的結(jié)構(gòu)示意圖如圖１－１Ｗ３２’３４］所示。在對逡逑ＡＫＲ２Ａ研宄時，研宄人員發(fā)現(xiàn)ＡＫＲ２Ａ的亮氨酸重復(fù)序列在其與底物蛋白的相互作逡逑用中沒有關(guān)鍵的作用，減去這段序列后不影響ＡＫＲ２Ａ與底物蛋白的相互作用。逡逑（＾ＯＩＶｉｒＴ＾）邐Ｅ３邋Ｌｉｇａｓｅ邐（＾ＡＰＸ３＾）逡逑Ｈａｖｏｉｄ邐Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ逡逑ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ邐邐邐＿邐Ｈ２0２邋ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ逡逑＾邋Ｓｃａｆｆｏｌｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邐邐逡逑ＣｊＴＯＰｌＪ）邐（１４－３－３邋ｐｒｏｔｅｉｎ）邐（＾ＡＫＲ２Ａ＾逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邐Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑（ｏｒ邋ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎ）邐＾逡逑１邋Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ邋ｓｉｇｎａｌ邐３邋１２逡逑Ａｎｋｙｒｉｎ邋ｒｅｐｅａｔｓ逡逑圖１－１伴侶蛋白ＡＫＲ２Ａ結(jié)構(gòu)示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ邋ＡＫＲ２Ａ逡逑進一步研究表明，除了邋ＡＰＸ３之外，ＡＫＲ２Ａ與葉綠體膜蛋白ＴＯＣ３４，過氧化物逡逑酶膜蛋白ＡＰＸ５，微粒體膜蛋白ＣＢ５－Ｂ和ＣＢＲ，及線粒體膜蛋白ＴＯＭ２０等都有互作逡逑關(guān)系１３５１。進一步研究發(fā)現(xiàn)，，ＡＫＲ２Ａ作用于膜蛋白的特殊信號序列，ＡＢＳ信號序列逡逑（ＡＫＲ２Ａ－ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）１３１’３２’３４１

游離脂肪酸被運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細胞質(zhì)基質(zhì)中進一步加工［６３，Ｍ］，一條途徑是碳鏈脫飽逡逑和，生成多不飽和脂肪酸，另一條途徑是碳鏈延長，生成ＶＬＣＦＡ。ＶＬＣＦＡ的合成是逡逑脂肪酸合成第二階段，如圖１－４［６５］所不。由脂肪酸碳鏈延長酶（ＦａｔｔｙＡｃｉｄＥｌｏｎｇａｓｅ）逡逑催化完成，以質(zhì)體中合成的１６Ｃ或１８Ｃ脂肪酸為底物，以丙二酰－ＣｏＡ為２Ｃ供體，逡逑經(jīng)過四步延伸反應(yīng)，脂酰－ＣｏＡ首先和丙二酰－ＣｏＡ在３－酮脂酰－ＣｏＡ縮合酶（ＫＣＳ）逡逑催化下生成３－酮脂酰－ＣｏＡ，然后，在３－酮脂酰－ＣｏＡ還原酶（ＫＣＲ）作用下還原成３－逡逑羥脂酰－ＣｏＡ，經(jīng)過３－羥脂酰－ＣｏＡ脫水酶（ＨＣＤ）脫水生成烯脂憸－ＣｏＡ，最后經(jīng)過烯逡逑脂酰－ＣｏＡ還原酶（ＨＣＲ）還原，在脂肪酸碳鏈末端添加２個碳原子。合成的ＶＬＣＦＡ逡逑作為蠟質(zhì)合成的前體物質(zhì)分別進入�；�原途徑或脫羰基途徑｜６６］。逡逑ＰＬ；ＡＳ７７Ｄ、逡逑ｉｆｌ邋Ｆａｔｔｙ邋Ａｄｄ邐ＩｊＢ邋Ｃ１８邋－邋Ｃ２０邋？邋Ｃ２２邋？邋Ｃ２４邋？邋Ｃ２６邋Ｃ２８邋？邋Ｃ３０邋－邋Ｃ３２邋？邋Ｃ３４逡逑Ｓｙｎｔｈａｓｅ邋（ＦＡＳ）逡逑Ｖ邐Ｃ１６邋Q咤澹茫繡危巍五義希埽茫保福粒茫繡澹危懼澹遙牛模眨茫裕桑希五義希耄悖簀澹ㄥ危疲幔簦簦澹粒悖椋溴�、ｈｃｄ辶x希茫保叮

本文編號：2614073