發(fā)布時間：2020-03-31 10:35

【摘要】：樺褐孔菌Inonotus obliquus或Fuscoporia obliqua是一種非常珍貴的多孔菌科褐臥孔菌屬藥用真菌,其主要寄生在白樺樹等樹皮或者樹干下,子實體呈現(xiàn)不規(guī)則的黑色瘤狀。其主要分布在北半球高緯度寒冷地區(qū),如波蘭、芬蘭、俄羅斯,以及中國的黑龍江,吉林等地。樺褐孔菌具有多種藥理活性,如抗癌、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等。黑色素的生物合成是真菌抵御環(huán)境脅迫的重要生存策略,真菌通過DHN和DOPA途徑合成黑色素,但樺褐孔菌水溶性黑色素的合成不受這兩個途徑的專化性抑制劑熊果苷或三環(huán)唑抑制。前期研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌一雜合的非核糖體肽合成酶-聚酮合成酶基因(nrps-pks)表達(dá)產(chǎn)物與其水溶性黑色素相似,且該基因與蛋白激酶、二肽酶及溶血素共調(diào)蛋白等10個基因形成NPM(非核糖體肽聚酮)基因簇。為了研究樺褐孔菌NPM基因簇的相關(guān)功能,本文將在實驗室前期研究的基礎(chǔ)上展開以下研究:1.以構(gòu)巢曲霉分子遺傳操作體系為基礎(chǔ),以同源重組和融合PCR技術(shù)為手段,構(gòu)建構(gòu)巢曲霉NPM基因簇表達(dá)菌株。2.以釀酒酵母異源表達(dá)體系為基礎(chǔ),以質(zhì)粒重組技術(shù)為手段,構(gòu)建釀酒酵母nrps-pks分段表達(dá)菌株。3.以乳酸乳球菌NICE蛋白表達(dá)體系為基礎(chǔ),以質(zhì)粒重組技術(shù)為手段,構(gòu)建乳酸乳球菌HCP基因表達(dá)菌株。4.以構(gòu)巢曲霉wA位點轉(zhuǎn)入nrps-pks基因及NPM基因簇的菌株為基礎(chǔ),以四種不同氨基酸做底物,研究其表型變化。實驗結(jié)果顯示:經(jīng)過長達(dá)十次的分段轉(zhuǎn)化成功將樺褐孔菌NPM基因簇完整轉(zhuǎn)入構(gòu)巢曲霉wA位點;以質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建的nrps-GST-pXW55載體和nrps-pksGST-pXW55載體在釀酒酵母中得到了成功表達(dá);以質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建的HCPpNZ8148在乳酸乳球菌中得到了成功的表達(dá);經(jīng)過四種氨基酸做底物,培養(yǎng)基中菌株均出現(xiàn)了不同程度的表型變化,尤其是以苯丙氨酸,色氨酸和異亮氨酸做底物時表型變化最為明顯。結(jié)果顯示NRPS-PKS最優(yōu)先選擇異亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸為底物,具有底物特異性。本研究雖以樺褐孔菌NPM基因簇及相關(guān)基因異源表達(dá)菌株的構(gòu)建為基礎(chǔ),但這將為后續(xù)nrps-pks表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)單元、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及NPM基因簇中與nrps-pks轉(zhuǎn)錄激活、表達(dá)產(chǎn)物結(jié)飾以及跨膜轉(zhuǎn)運密切相關(guān)的基因功能研究提供必須材料,進(jìn)而為開展樺褐孔菌黑色素合成新途徑的研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 DHN（a）和 DOPA（b）黑色素的結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 Structure of DHN（a）and DOPA（b） 1-2 DOPA（A）和 DHN（B）黑色素的合成途The way of DOPA（A）and DHN（B）melanin合成的生物學(xué)意義菌生物體賴以生存的必需物質(zhì)，但是其

圖 1-2 DOPA（A）和 DHN（B）黑色素的合成途徑Fig.1-2 The way of DOPA（A）and DHN（B）melanin synthesis菌黑色素生物合成的生物學(xué)意義色素雖然不是真菌生物體賴以生存的必需物質(zhì)，但是其獨特的生理功能的生活史中產(chǎn)生著巨大的作用。比如黑色素可以顯著增強(qiáng)真菌生物體在環(huán)境中存活能力和競爭能力，是真菌在高溫、寒冷、高鹽、高輻射、干旱件下的重要保護(hù)傘。與此同時，真菌致病性的強(qiáng)弱也是和黑色素的合成有聯(lián)系[8]。然而近些年以來，真菌黑色素的抗輻射和抗腫瘤作用是整個科學(xué)熱點。如在長期受到核輻射地區(qū)發(fā)現(xiàn)了可以大量繁殖的黑色真菌[9]，它們能力很強(qiáng)。此外也有發(fā)現(xiàn)表明，，受紫外線輻射較為強(qiáng)烈的地區(qū)黑曲霉孢子的含量遠(yuǎn)高于未受紫外線輻射的黑曲霉[10]。這些發(fā)現(xiàn)均說明了真菌黑色
【學(xué)位授予單位】：江蘇師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.3

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本文編號：2608963