【摘要】：羅非魚作為我國重要的淡水養(yǎng)殖及出口品種,但是近幾年鏈球菌病的暴發(fā)引起的高死亡率,已經(jīng)嚴(yán)重影響到羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此培育抗病品系,可有效控制鏈球菌病的暴發(fā)。本研究以與免疫功能密切相關(guān)的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)基因為研究對象,通過分析MHC基因的多態(tài)性及其與鏈球菌病之間的關(guān)系以及不同群體中MHCⅡA基因多態(tài)性和遺傳特性;以期為尼羅羅非魚(Oreochromis niloicus)抗病基因篩選及抗病品種的選育奠定基礎(chǔ)。取得主要研究結(jié)果如下:1.尼羅羅非魚MHC ⅡA基因多態(tài)性與無乳鏈球菌抗性的關(guān)聯(lián)分析本研究利用尼羅羅非魚40尾易感個體和40尾抗病個體進(jìn)行MHCⅡA基因多態(tài)性與無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)抗性的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示,擴(kuò)增獲得的片段長度為647-775 bp。從80尾尼羅羅非魚個體中共檢測到25個等位基因,隸屬于22個等位基因主型。尼羅羅非魚中的MHC ⅡA基因的第二外顯子區(qū)域具有高度多態(tài)性,并且該基因中至少存在兩個基因座。在抗原識別區(qū)域(PBR)和非抗原識別區(qū)域(Non-PBR)區(qū)域的非同義突變率和同義突變率的比值為1.294(1)和1.240(1),表明尼羅羅非魚MHC ⅡA基因的第二外顯子區(qū)域在進(jìn)化過程中受正向選擇作用影響。在第一次感染實驗中發(fā)現(xiàn)等位基因Orni-DAA*0501與無乳鏈球菌抗性性狀顯著相關(guān),等位基因Orni-DAA*1/01,Orni-DAA*1301,Orni-DAA*1401和Orni-DA4*1201與無乳鏈球菌易感性狀顯著相關(guān)。本實驗為了證實MHC ⅡA特定等位基因與無乳鏈球菌抗性的相關(guān)性,利用惠州尼羅羅非魚群體進(jìn)行第二次感染實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn),等位基因Orni-DAA*1101在惠州易感群體(HZ-SG)中的頻率顯著高于惠州抗病群體(HZ-RG)的頻率(P0.05)。然而,等位基因 Orni-DA4*0501 在 HZ-SG 和 HZ-RG 中并不存在,并且Orni-DA*1201,Orni-DAA*1301和Orni-DAA*140 等位基因的分布頻率在HZ-RG高于HZ-SG。由此表明,等位基因Orni-DAA*1101在尼羅羅非魚的分子輔助育種計劃中,可作為與疾病易感相關(guān)的分子標(biāo)記。2.尼羅羅非魚MHC ⅡB基因多態(tài)性與無乳鏈球菌抗性的關(guān)聯(lián)分析本研究通過對20個家系1800尾尼羅羅非魚(F1)進(jìn)行無乳鏈球菌的感染實驗,每個家系具有不同的存活率。根據(jù)每個家系的抗病能力,本實驗從20個家系中挑選12個家系(從P0代親本的每個家系中挑選20尾尼羅羅非魚)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,擴(kuò)增獲得的片段長度為770-797 bp,從240個個體的1423條序列中共發(fā)現(xiàn)22個不同的等位基因,9個等位基因主型。其中核苷酸位點(diǎn)變異百分比為63.58%,氨基酸變異百分百為63.58%。β1和β2結(jié)構(gòu)域整體的非同義突變率和同義突變率的比值為1.4595,由此說明尼羅羅非魚MHCⅡB基因在進(jìn)化過程中受正向選擇作用的影響。根據(jù)12個家系(F1)在感染無乳鏈球菌后的存活率,由此判定,等位基因 Orni-DAB*0107,Orni-DAB*0201 和 Orni-DAB*0302 與無乳鏈球菌抗性性狀顯著相關(guān),等位基因Orni-DAB*0701與無乳鏈球菌易感性狀顯著相關(guān)。然而本實驗團(tuán)隊前期發(fā)現(xiàn)等位基因Orni-DAB*0201與無乳鏈球菌抗性性狀相關(guān),因此,在尼羅羅非魚的抗病品種選育過程中,可將等位基因Orni-DAB*0201用作抗病相關(guān)分子標(biāo)記。3.尼羅羅非魚β2m基因單核苷酸多態(tài)性與無乳鏈球菌抗性的關(guān)聯(lián)分析β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)作為MHCⅠ類分子的重要組成部分,在魚類的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。本實驗采用直接測序法從P0代尼羅羅非魚的β2m基因序列中篩選到30個SNPs,21個SNPs位于外顯子區(qū)域(其中1個SNP位于5'UTR,4個SNPs位于3'UTR,16個非同義突變位點(diǎn),1個同義突變位點(diǎn)),9個SNPs位于內(nèi)含子區(qū)域。利用Snapshot分型法對F1代的102尾易感個體和102尾抗病個體進(jìn)行基因分型,并通過Popgen32和PIC-CALC軟件統(tǒng)計分析尼羅羅非魚β2m基因序列的SNPs的He、Ho、Ne和PIC等遺傳參數(shù),表明易感群體中7個SNPs為中度多態(tài)水平(0.25PIC0.5),抗病群體中25個SNPs為中度多態(tài)水平(0.25PIC0.5)。采用SPSS 23.0軟件分析了 30個SNPs在F1代兩個群體中的基因型頻率和等位基因頻率,分析其與鏈球菌抗性或易感性狀之間的關(guān)系。結(jié)果表明:24個SNPs的基因型和等位基因頻率與無乳鏈球菌抗性/易感性狀密切相關(guān)(PO.05)。通過Haploview軟件分析發(fā)現(xiàn)30個SNPs構(gòu)成4個單倍塊和14種單倍型。其中,4個單倍型與無乳鏈球菌抗性性狀密切相關(guān)(P0.05),4個單倍型與易感性狀密切相關(guān)(P0.05)。標(biāo)簽SNP分析發(fā)現(xiàn),單倍塊2的4個SNPs和單倍塊3中的13個SNPs彼此之間高度連鎖(r20.9),這意味著我們在β2m基因中發(fā)現(xiàn)2個htSNPs。本研究篩選到的與鏈球菌抗性/易感性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)及單倍型具有輔助尼羅羅非魚抗鏈球菌病品種選育的潛力。4.3個不同尼羅羅非魚群體MHC ⅡA基因多態(tài)性和遺傳分化本研究從廣東省3個不同養(yǎng)殖地區(qū)的91尾尼羅羅非魚的個體中獲得了MHCⅡA的第二外顯子區(qū)域序列共501條,長度為647～742 bp。對該序列進(jìn)行分析,共發(fā)現(xiàn)12個MHCⅡA等位基因。三個群體中核苷酸序列變異比例為34.73%～60.78%,氨基酸變異比例為68.24%～78.82%,其中惠州群體的變異比例最高(60.78%和78.82%)。遺傳多樣性分析表明:三個群體中惠州群體的遺傳多樣性參數(shù)最高。群體間分化指數(shù)(Fst)、中性檢測(Tajima檢測)、平均基因流、平均K2-P遺傳距離和AMOVA分析的各項數(shù)據(jù)表明MHC ⅡA基因的第二外顯子區(qū)域在3個不同群體間遺傳分化不顯著,存在一定的基因交流。本研究發(fā)現(xiàn)的MHCⅡA基因的高度多態(tài)性及遺傳結(jié)果,為尼羅羅非魚抗病品種的選育以及種質(zhì)資源的保護(hù)奠定了重要的基礎(chǔ)資料。
【圖文】：

邐煙媻太律論文邐逡逑突變比例高達(dá)９５．２４％，在非ＰＢＲ區(qū)域中氨基酸變異比例為９０．１６％（５５／６１）。從表１邋－２逡逑中可以發(fā)現(xiàn)叫結(jié)構(gòu)域中的ＰＢＲ區(qū)域的ｗ值大于Ｎｏｎ－ＰＢＲ區(qū)域，山結(jié)構(gòu)域整體00值大逡逑于１，表明尼羅羅非魚ＭｆｆＣ邋／Ｚ４基囡的0４結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過程中受到正向選擇逡逑（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）影響邋0逡逑ｗ

本實驗從４５９條有效序列中共發(fā)現(xiàn)２５個等位基因。２５個等位基囡的分布頻率逡逑差別較大，其中等位塞因＜９ｒｗ＋－ｍ４＊０７０７在兩個群體中的分布頻率最高（５２．８４％，逡逑５２．０７％）（圖１－３）。另外一些等位基ｇ僅出現(xiàn)１－２次，例如等位基ｇ邋（９Ｗ７＋－Ｄ崩＊０９０３、逡逑Ｏｒｎｉ－ＤＡＡ＊０２０』、Ｏｒｎｉ－ＤＡＡ＊２２０』、Ｏｍｉ－ＤＡＡ＊ｊ0０】和邋Ｏｒｎｉ－ＤＡＡ＊２３（Ｈ邋共邋５邋個等逡逑位基因出現(xiàn)在易感群體，等位、逡逑１５逡逑
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S943

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本文編號：2607797