【摘要】：COMMD蛋白是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的一類蛋白家族,在多細(xì)胞生物中廣泛存在。COMMD蛋白家族包括COMMD1～10十個(gè)成員,對(duì)COMMD蛋白序列的分析表明,COMMD蛋白包含200個(gè)左右氨基酸殘基,所有蛋白成員的羧基末端都具有一個(gè)由70-85個(gè)氨基酸組成的高度保守的COMM結(jié)構(gòu)域,在蛋白之間發(fā)生相互作用時(shí)發(fā)揮界面的作用。COMMD蛋白是一個(gè)多效性因子,參與多種細(xì)胞生理反應(yīng),包括銅代謝、納轉(zhuǎn)運(yùn)、核因子κB(NF-κB)的調(diào)控以及細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)。NF-κB在免疫反應(yīng)中起開關(guān)作用,既能被上調(diào)有助于機(jī)體抵抗外部病原體的入侵,又能被下調(diào)防止過(guò)度免疫對(duì)機(jī)體造成損傷。最近研究發(fā)現(xiàn),COMMD蛋白家族成員可能在核內(nèi)參與防止NF-κB的過(guò)度活化,避免對(duì)機(jī)體造成損傷的調(diào)控,進(jìn)而參與免疫調(diào)節(jié)。文昌魚在進(jìn)化地位上處于從無(wú)脊椎動(dòng)物進(jìn)化到脊椎動(dòng)物的過(guò)渡物種,在結(jié)構(gòu)和發(fā)育上都可以作為脊椎動(dòng)物祖先的模型,是研究動(dòng)物學(xué)免疫和進(jìn)化的重要模式生物。為了進(jìn)一步研究COMMD家族基因的功能和進(jìn)化,本論文以文昌魚COMMD家族基因?yàn)檠芯繉?duì)象,通過(guò)基因克隆、實(shí)時(shí)定量PCR、生物信息分析等技術(shù)手段對(duì)該家族成員的功能及進(jìn)化進(jìn)行分析,得到以下的研究結(jié)果:(1)采用RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)克隆得到白氏文昌魚COMMD家族基因全長(zhǎng)序列(AmphiCOMMDs)。對(duì)文昌魚AmphiCOMMDs序列分析顯示,AmphiCOMMD家族蛋白大約由200個(gè)氨基酸殘基組成,羧基端均包含由70-85個(gè)氨基酸構(gòu)成的保守的COMM結(jié)構(gòu)域,而各成員在氨基末端差異較大。對(duì)COMMD家族的基因組結(jié)構(gòu)及相位分析顯示COMMD3和COAMMD8在脊索動(dòng)物中是保守的,而COAMMD1,2,4,7,9則只在脊椎動(dòng)物中保守。此外,COMMD5和COMMD6只在文昌魚和斑馬魚中保守。總體上來(lái)說(shuō)COMMD家族基因結(jié)構(gòu)及相位的變化是多樣的。與尾索動(dòng)物海鞘相比,文昌魚COMMD家族的基因結(jié)構(gòu)更接近于脊椎動(dòng)物。(2)為了探索COMMD家族的起源與進(jìn)化,采用貝葉斯法對(duì)白氏文昌魚及處于不同進(jìn)化地位的代表性物種的COMMD蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示文昌魚COMMD家族的十個(gè)成員分別聚集到各自的亞家族。在各亞簇中白氏文昌魚AmphiCOMMDs基因處于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間,與姐妹物種海鞘相比,白氏文昌魚與脊椎動(dòng)物的關(guān)系極為接近,這與基因結(jié)構(gòu)及相位分析的結(jié)果一致,果蠅則位于每個(gè)亞家族簇的底部。保守的基序分析顯示所有的十個(gè)COMMD家族成員均包含保守基序1和2,基序7只存在于COMMD3,4,5,7,10中,基序11則只存在于COMMD4,5,7,10中。其它的基序特異的存在于不同的亞家族中,特異基序的存在可能與蛋白功能的分化等有關(guān)。選擇壓力分析顯示,在進(jìn)化過(guò)程中COMMD家族成員受到較強(qiáng)的選擇壓力,但也存在一些正選擇位點(diǎn),為COMMD家族成員結(jié)構(gòu)和功能的多樣化提供了保證,我們的研究結(jié)果為更好地理解COMMD家族基因的功能和進(jìn)化提供了重要線索。(3)為研究白氏文昌魚AmphiCOMMDs基因的抗菌功能,我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)AmphiCOMMDs基因在不同組織內(nèi)(鰓、肝盲囊、腸、肌肉、脊索)以及LPS注射后的不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。結(jié)果表明除AmphiCOMMD3和AmphiCOMMD5之外,AmphiCOMMDs基因在五種組織中的表達(dá)趨勢(shì)相近,AmphiCOMMD3在肝盲囊、腸和脊索三個(gè)組織中的表達(dá)水平較高,AmphiCOMMD5在腸中的表達(dá)水平相對(duì)較高。LPS刺激后AmphiCOMMDs基因的表達(dá)水平存在不同程度的波動(dòng),推測(cè)文昌魚COMMD成員在應(yīng)對(duì)外界刺激時(shí)可能參與了 NF-κB通路的調(diào)控。
【圖文】：

２．３．１采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取白氏文昌魚的總ＲＮＡ逡逑用Ｔｒｉｚｏｌ法提取白氏文昌魚的總ＲＮＡ，瓊脂糖凝膠電泳后在紫外凝膠成像系統(tǒng)逡逑中檢測(cè)，結(jié)果如圖２．１所示：逡逑Ｍ邋１逡逑■Ｉｆ逡逑■逡逑圖２．１文昌魚總ＲＮＡ的提取逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ａｍｐｈｉｏｘｕｓ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１邋？？總邋ＲＮＡ逡逑２７逡逑

激文昌魚后在不同時(shí)間點(diǎn)提取文昌魚的總ＲＮＡ并反轉(zhuǎn)錄為ｃＤＮＡ，以ｙＳ－ａｃｒｉｗ基因逡逑為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量ＰＣＲ反應(yīng)。基因和ｆ－ａｃＯ基因的實(shí)時(shí)熒逡逑光表達(dá)如圖４．１：文昌魚經(jīng)ＬＰＳ刺激后，和的表達(dá)逡逑水平先下調(diào)后恢復(fù)正常，而Ｊｍ／Ａ／ＣＯＭＭＤＰ的表達(dá)水平先上調(diào)后恢復(fù)正常，，同時(shí)，逡逑和的表達(dá)水平先下調(diào)后又表現(xiàn)為上調(diào)，與之相反，逡逑與知ＣｍＴＭＤ３、柳／／／ＣＯＭＭＤ７和柳／ＨＣＯＭＭＤＳ的表達(dá)水平為先上調(diào)然后下逡逑調(diào)。逡逑４３逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

【相似文獻(xiàn)】

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1 呂彩云;白氏文昌魚COMMD基因家族的克隆與免疫功能的初步分析[D];南京師范大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2607433