【摘要】：植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需要抵御復(fù)雜多樣的生物及非生物脅迫,如營(yíng)養(yǎng)脅迫、重金屬脅迫、真菌病害脅迫,而脅迫往往同時(shí)或接連發(fā)生,甚至存在一定的相互作用。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中建立了復(fù)雜且精密的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以抵御這些脅迫。植物激素及重要的功能蛋白如轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、病程相關(guān)蛋白通常參與了植物對(duì)多種脅迫的響應(yīng)過(guò)程。已有研究發(fā)現(xiàn),植物響應(yīng)脅迫的機(jī)制存在一定的交叉,這種交叉可能導(dǎo)致協(xié)同和拮抗兩種結(jié)果。因此,比較研究不同脅迫條件下玉米響應(yīng)的分子機(jī)制,進(jìn)一步解析這些響應(yīng)機(jī)制之間的差異及相互作用,有利于解析玉米響應(yīng)脅迫因子的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),最終為玉米遺傳改良提供參考。玉米作為我國(guó)第一,大糧食作物,在保障糧食安全、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。西南地區(qū)是中國(guó)第三大玉米主產(chǎn)區(qū),其獨(dú)特的地理和氣候環(huán)境導(dǎo)致玉米在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受到多種生物及非生物脅迫,嚴(yán)重制約西南地區(qū)玉米生產(chǎn)發(fā)展。本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,對(duì)西南地區(qū)玉米生產(chǎn)過(guò)程中受到三種重要脅迫類(lèi)型展開(kāi)研究,包括低氮、重金屬鎘及穗粒腐病菌脅迫。利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)策略及分子生物學(xué)手段對(duì)不同玉米材料的脅迫響應(yīng)機(jī)制展開(kāi)研究,構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),挖掘并鑒定重要的脅迫響應(yīng)候選基因,初步揭示玉米響應(yīng)上述脅迫因子的調(diào)控機(jī)制及交叉互作關(guān)系,獲得具有一定應(yīng)用價(jià)值的基因資源和重要功能基因,為后期培育綜合性狀優(yōu)良的玉米品種奠定理論基礎(chǔ)和材料基礎(chǔ)。本研究獲得主要研究結(jié)果如下:1.為了揭示玉米對(duì)禾谷鐮刀菌的抗性機(jī)制,在課題組前期研究基礎(chǔ)上,本研究對(duì)人工接菌48 h、72 h和96 h后的抗玉米穗粒腐病材料IBM_81和感病材料IBM_85的花絲組織進(jìn)行取樣測(cè)序,鑒定差異表達(dá)基因。在6個(gè)比較組中共檢測(cè)到5760個(gè)差異表達(dá)基因。其中僅有6個(gè)共表達(dá)差異基因,功能注釋結(jié)果顯示這些差異基因與防御響應(yīng)相關(guān)。其中,位于基因間隔區(qū)的一個(gè)長(zhǎng)非編碼RNA(lincRNA)在病菌脅迫后顯著上調(diào)表達(dá),可能參與了玉米對(duì)禾谷鐮刀菌的脅迫響應(yīng)。差異表達(dá)基因功能富集分析結(jié)果表明差異表達(dá)基因在防御響應(yīng)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物與病菌互作、苯丙烷合成通路中顯著富集。在感病材料IBM_85中,光合作用相關(guān)的基因在72 h表達(dá)受到病菌脅迫的抑制,而這種抑制作用在抗病材料IBM_81中96 h才出現(xiàn)。對(duì)植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析發(fā)現(xiàn),JA應(yīng)答通路負(fù)向調(diào)控因子ZmJAZs在抗、感材料中表達(dá)差異顯著�？共〔牧现衂mJAZs成員表達(dá)量較低,利于激活JA應(yīng)答通路,提高植株抗性。另有ZmOPR1、ZmOPR2和ZmOPR5也參與了玉米對(duì)禾谷鐮刀菌的脅迫響應(yīng)。2.病程相關(guān)蛋白 PR1家族成員在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路、植物激素信號(hào)通路和植物與病原菌互作中均具有重要作用。本研究在玉米中共鑒定出12個(gè)具有典型結(jié)構(gòu)域的PR1基因家族成員。轉(zhuǎn)錄豐度變化表明4個(gè)編碼PR1蛋白的基因在玉米花絲及苞葉中參與了禾谷鐮刀菌脅迫響應(yīng)。其中,ZmPR1-11在苞葉中大量表達(dá),且在感病材料中具有更高的表達(dá)豐度,該基因可能具有廣譜抗性。3.為探究玉米抵御低氮脅迫的響應(yīng)機(jī)制,本研究在不同氮素處理、不同時(shí)間點(diǎn)(12 h、24 h、48 h、96 h)對(duì)玉米根系突變體rtcs及野生型的根系形態(tài)和生理變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明,低氮脅迫抑制供試材料谷氨酰胺合成酶活性,降低總蛋白含量;玉米初生根長(zhǎng)度及側(cè)根總長(zhǎng)在低氮脅迫下均增長(zhǎng),且突變體變化更為明顯。上述結(jié)果表明,在低氮條件下突變體rtcs能夠通過(guò)初生根延長(zhǎng)及側(cè)根補(bǔ)償性生長(zhǎng)彌補(bǔ)其種子根、莖生根缺失導(dǎo)致的氮素吸收缺陷。4.利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法對(duì)突變體rtcs與野生型在不同時(shí)間點(diǎn)、不同氮素水平處理下轉(zhuǎn)錄水平動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行比較分析,共鑒定出786個(gè)與根系發(fā)育相關(guān)的共表達(dá)基因,這些基因參與了不同的生物學(xué)過(guò)程。其中ZmJA27和bHLH103在突變體中表達(dá)豐度較低,且在低氮脅迫后上調(diào)表達(dá)。共表達(dá)類(lèi)群建立及順式調(diào)控元件分析結(jié)果表明,AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員在依賴于rtcs的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。本研究進(jìn)一步鑒定出403個(gè)具有不同生物學(xué)功能的共表達(dá)基因參與了低氮脅迫響應(yīng)。比較分析結(jié)果揭示出控制植物根系發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響低氮脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。AUX/IAA-ARF-LBD-bHLH-AP2-EREBP和JAZ介導(dǎo)的JA應(yīng)答通路調(diào)控模塊在維持玉米根系發(fā)育與低氮脅迫響應(yīng)之間的平衡中可能具有重要作用。5.基于課題組前期研究結(jié)果,本研究采用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法檢測(cè)玉米自交系B73、Mo17在重金屬鎘脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平變化,以揭示玉米響應(yīng)重金屬鎘脅迫的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)�；虿町惐磉_(dá)分析共鑒定出在不同材料、不同脅迫時(shí)間點(diǎn)共表達(dá)差異基因115個(gè),主要包括脅迫響應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等,如ZmNAC70、ZmRAN1、ZmJAZs和ZmOPRs。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建共鑒定出12個(gè)共表達(dá)模塊,不同共表達(dá)模塊中的基因參與了不同的生物學(xué)過(guò)程。值得注意的是,部分重金屬脅迫響應(yīng)基因參與了其它類(lèi)型的生物及非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程,如ZmJAZs及ZmOPRs。6.基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結(jié)果,本研究進(jìn)一步對(duì)OPR蛋白家族成員在響應(yīng)鎘脅迫過(guò)程中的功能進(jìn)行研究。在玉米基因組中共鑒定出8個(gè)OPR家族成員。其中ZmOPR5編碼OPR Ⅰ類(lèi)蛋白,在鎘脅迫下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明其蛋白定位于細(xì)胞膜。在鎘脅迫條件下,ZmOPR5的擬南芥同源突變體αtopr2的根系生長(zhǎng)受到明顯抑制,表現(xiàn)出鎘敏感的表型。上述結(jié)果表明OPR蛋白家族成員在玉米根系響應(yīng)鎘脅迫過(guò)程中具有不同的生物學(xué)功能,OPRⅠ類(lèi)蛋白可能具有抵御氧化脅迫、細(xì)胞解毒的功能。其中ZmOPR5可能通過(guò)其在鎘脅迫響應(yīng)中類(lèi)似的作用機(jī)制參與禾谷鐮刀菌毒素轉(zhuǎn)運(yùn)或者轉(zhuǎn)化,降低毒素對(duì)細(xì)胞的傷害。ZmOPR2同樣也具有功能多樣性,參與了鎘脅迫及禾谷鐮刀菌響應(yīng)過(guò)程,其編碼的蛋白質(zhì)的底物特異性決定位點(diǎn)氨基酸不同于ZmOPR5,表明其可能具有與ZmOPR5不同的功能。7.本研究針對(duì)上述脅迫響應(yīng)過(guò)程中的差異表達(dá)基因比較發(fā)現(xiàn),一些重要的功能基因參與了多種脅迫響應(yīng)過(guò)程。ZmJAZ7同時(shí)參與了根系發(fā)育、低氮脅迫、Cd脅迫及禾谷鐮刀脅迫響應(yīng)過(guò)程,其可能通過(guò)對(duì)JA應(yīng)答通路的調(diào)節(jié)平衡生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng),以使植株適應(yīng)多種逆境環(huán)境,保證植株正常生長(zhǎng)發(fā)育。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)過(guò)程中具有重要作用,本研究中鑒定出多個(gè)AP2-EREBP家族成員參與了根系發(fā)育及脅迫響應(yīng)。ZmOPR2和ZmOPR5通過(guò)獨(dú)立于JA合成通路的途徑同時(shí)參與了鎘脅迫及禾谷鐮刀脅迫響應(yīng),且兩者對(duì)其他病菌的入侵也具有防御作用,可能具有較廣的抗性。ZmPR1-2和ZmPR1-11的主要表達(dá)部位不同,分別參與了花絲和苞葉中的禾谷鐮刀菌脅迫響應(yīng)過(guò)程。上述結(jié)果表明玉米的生物及非生物脅迫響應(yīng)調(diào)控通路存在交叉,進(jìn)一步解析上述重要功能基因在多種脅迫響應(yīng)過(guò)程中的功能及脅迫響應(yīng)通路之間的互作,將為作物遺傳改良提供更為全面的信息,利于培育優(yōu)良的抗逆新品種。
【圖文】：

根上側(cè)根總長(zhǎng)（LRL）為主要研究指標(biāo)，這兩個(gè)指標(biāo)能夠較好的反應(yīng)出兩個(gè)材料在不同氮水平條件下的差異情況。根系形態(tài)分析結(jié)果顯示，，在種子萌發(fā)后 8d天時(shí)突變體及野生型根系表現(xiàn)出顯著形態(tài)差別，突變體中缺失種子根（圖3.1A）。在正常氮水平條件下，突變體的 PRL、 LRL 長(zhǎng)于野生型。隨著生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，這種差距持續(xù)增大（圖 3.1B）。前人發(fā)現(xiàn)植物初生根及其側(cè)根對(duì)于植物早期定植土壤及吸收營(yíng)養(yǎng)元素十分重要，兩者的增長(zhǎng)利于植物在低氮條件下吸收氮素[125]。在根系生長(zhǎng)受到限制的情況下，植物可以通過(guò)改變剩余根系的表型來(lái)增加氮吸收，而不是通過(guò)增加氮吸收比率的方式[126]。在低氮脅迫條件下，兩個(gè)材料的 PRL、 LRL 均呈現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，而突變體的 LRL 相較于野生型變化更大（圖 3.1B）。為比較根系變化對(duì)氮素吸收利用率的影響

為了更加深入的研究依賴于 rtcs 的根系發(fā)育相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)， 研究將所有顯著差異表達(dá)的 DEGs 依據(jù)其動(dòng)態(tài)表達(dá)模式進(jìn)行 SOTA 聚類(lèi)分析，最終 7418DEGs 被劃分至 11 個(gè)共表達(dá)類(lèi)群，表征根系發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的變化（圖3.5A）。其中，共表達(dá)類(lèi)群 9-11 在野生型中表達(dá)量顯著高于突變體，表明這些基因與依賴于 rtcs 的根系發(fā)育相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)緊密相關(guān)（圖 3.5B）。針對(duì)這三個(gè)共表達(dá)類(lèi)群中的 DEGs 進(jìn)一步進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域順式調(diào)控元件分析，均鑒定出ABI4 （MA0123.1） 和 ERF1 （MA0567.1, 圖 3.5B） 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，而ABI4 及 ERF1 轉(zhuǎn)錄因子都屬于 AP2-EREBP 轉(zhuǎn)錄因子家族，該轉(zhuǎn)錄因子家族參與調(diào)控了許多重要的生物學(xué)過(guò)程，例如，植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖發(fā)育、細(xì)胞增殖、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物及非生物脅迫響應(yīng)等。在上述共表達(dá)類(lèi)群中共鑒定出 27 個(gè)AP2-EREBP 家族基因。上述結(jié)果表明 AP2-EREBP 轉(zhuǎn)錄因子家族成員在依賴于rtcs 的根系發(fā)育相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的具有重要功能。表達(dá)量熱圖顯示出這 27 個(gè)AP2-EREBP 家族基因在突變體與野生型呈現(xiàn)差異性表達(dá)，且在野生型中平均表達(dá)量明顯高于突變體中的表達(dá)量（圖 3.5C）。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S513

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本文編號(hào)：2605688