【摘要】：蝴蝶蘭是蘭科植物中栽培最廣泛、最受歡迎的種類之一,其花形多姿多態(tài),花色艷麗豐富,葉形優(yōu)美,具有重要的觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值,在熱帶蘭中素有“蘭花皇后”之美譽(yù),國(guó)內(nèi)外一直視其為花中珍品,深得消費(fèi)者青睞。然而由于基因資源的限制,通過(guò)傳統(tǒng)的育種手段不能獲得藍(lán)色的新異色系,但利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)則可以突破物種限制,可以往蝴蝶蘭的基因庫(kù)中導(dǎo)入新的基因,從而使藍(lán)色花的培育成為可能。蝴蝶蘭花色形成機(jī)理、花色素化學(xué)分析和花色轉(zhuǎn)基因育種等研究較為初步,同時(shí)蝴蝶蘭品種特異性強(qiáng)、遺傳轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題也沒(méi)有得到有效解決。因此,建立一套可以快速在蝴蝶蘭花器官中進(jìn)行性狀檢測(cè)和基因功能分析的早期驗(yàn)證系統(tǒng),分析蝴蝶蘭轉(zhuǎn)藍(lán)色功能基因的研究,對(duì)蝴蝶蘭以及單子葉藍(lán)色花育種具有重要的理論意義和實(shí)際意義。1.本研究建立了蝴蝶蘭花瓣瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明:農(nóng)桿菌菌液OD_(600)為0.6、侵染時(shí)間60 s,在重懸液中添加150μmol/L乙酰丁香酮,共培養(yǎng)3 d,GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高,達(dá)到85.01%。將查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因RNAi干擾載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭花瓣,共培養(yǎng)3 d后觀察轉(zhuǎn)化材料中花色表型以及色素的變化。轉(zhuǎn)基因蝴蝶蘭花瓣顏色明顯變淡,色素含量降低,半定量PCR檢測(cè)表明CHS基因的轉(zhuǎn)錄活性相比于對(duì)照組顯著降低。該實(shí)驗(yàn)成功的在蝴蝶蘭花器官中建立了一種快速基因功能驗(yàn)證方法,為后期蝴蝶蘭基因功能研究和育種工作提供技術(shù)支持。2.采用半定量RT-PCR的方法分析類黃酮通路結(jié)構(gòu)基因CHS、DFR、F3’H在蝴蝶蘭滿天紅品種花不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。結(jié)果表明不同基因在花瓣和萼片各時(shí)期表達(dá)量雖有差異,但在滿天紅品種中總體趨勢(shì)一致。在花開(kāi)放之前三個(gè)基因表達(dá)量較高,花開(kāi)放之后表達(dá)量均顯著下降。3.使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將phDFR、phCHS、phF3’H對(duì)應(yīng)的干擾載體以及Ih F3’5’H、MaF3’5’H、IhDFR、ThDFR、MaDFR等基因?qū)?yīng)過(guò)量表達(dá)載體對(duì)蝴蝶蘭進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。蝴蝶蘭內(nèi)源CHS、DFR、F3’H干擾載體轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭花瓣,結(jié)果顯示phCHS和phDFR基因干擾載體轉(zhuǎn)化的花瓣相比于對(duì)照組顏色明顯變淡,總花青苷含量測(cè)定結(jié)果顯示對(duì)照組分別是pKANNIBAL-phCHS組的5.75倍、是pKANNIBAL-phDFR組的2.56倍,而pKANNIBAL-phF3’H和水對(duì)照組幾乎沒(méi)有差異。4.干擾蝴蝶蘭內(nèi)源的DFR基因,同時(shí)過(guò)量表達(dá)外源葡萄風(fēng)信子的DFR和F3’5’H基因,能使花色變深。進(jìn)一步總花青苷含量檢測(cè)顯示,該組合的總花青苷含量是對(duì)照組的1.52倍。進(jìn)一步HPLC分析對(duì)照組和該實(shí)驗(yàn)組中花青素含量和成分,結(jié)果表明花青素含量有顯著增加,但沒(méi)有檢測(cè)出新的色素成分。
【圖文】：

并且有助于從黃色到紅色到藍(lán)色的各種種植物中。對(duì)花色起主要作用的類黃酮分于花瓣表皮細(xì)胞的液泡中(Tanaka et al. 2常集中在類黃酮途徑的代謝工程上。類黃化合物是最常見(jiàn)的花青素，并賦予植物各化學(xué)和分子生物學(xué)方面已得到很好的表征蛋白質(zhì)家族已經(jīng)在許多植物物種中所表個(gè)苯環(huán)和一個(gè)含氧雜環(huán)組成(C6-C3-C6)的基化位置和數(shù)目的不同將花青素主素(cyanidin)、芍藥素(peonidin, 即 3’-甲(petunidin，即 3’-甲基飛燕草素)和錦葵a et al. 2008)。

圖 1-2 花色相關(guān)的類黃酮合成途徑（Tanaka et al. 2005）Fig.1-2 Flavonoid biosynthesis pathway relevant to flower colour 藍(lán)色花形成機(jī)理花青素是水溶性色素，儲(chǔ)存在花瓣表皮細(xì)胞的液泡中，或在某些情況下，葉子的表細(xì)胞液泡中�；ㄉ剀盏念伾Q于化學(xué)結(jié)構(gòu)，，液泡 pH 值，共著色（通常由黃酮黃酮醇）和金屬離子絡(luò)合，最終的花瓣顏色是通過(guò)對(duì)這些因素的基因調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的或紫花的顏色可以通過(guò)用芳香族�；揎椀娘w燕草素花青素，較高（中性）液泡思蘭，2004)和共色素和/或金屬離子的存在來(lái)實(shí)現(xiàn)。其中，最主要原因是藍(lán)色色素積累，培育藍(lán)色花的主要技術(shù)路線是使花瓣中合成大量藍(lán)色花色素 （孟麗，2006）藍(lán)色花育種基因工程研究進(jìn)展玫瑰，康乃馨和菊花是最重要的花卉作物，但是植物自身不積累飛燕草素，它們?nèi)?
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S682.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2604926