【摘要】：動(dòng)脈硬化為中老年常見疾病,隨著高血壓、高血糖、高血脂等發(fā)病率不斷增高,動(dòng)脈粥樣硬化引起的心肌梗死、腦梗塞和肢體缺血壞死等危及生命的疾病越來越多,主要表現(xiàn)為動(dòng)脈狹窄,內(nèi)膜增生閉塞或栓塞,同時(shí),內(nèi)膜增生常伴隨疾病的發(fā)生發(fā)展,目前主要治療方式藥物及手術(shù)治療均無法逆轉(zhuǎn)這一病理改變,它也是動(dòng)脈旁路手術(shù),介入手術(shù)后再狹窄閉塞的重要原因,以下肢動(dòng)脈動(dòng)脈閉塞最為常見。在外周血管疾病(periphery artery disease,PAD)治療中側(cè)支循環(huán)的建立能一定程度改善相應(yīng)的癥狀,減緩疾病的進(jìn)展甚至到達(dá)治愈的療效,這一過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular Endothelial Cells,VECs)的激活、增值、遷移、管腔結(jié)構(gòu)的形成及塑性,并以出芽的方式形成新生血管網(wǎng)為保障側(cè)支循環(huán)建立的關(guān)鍵所在,側(cè)支循環(huán)建在增加末梢血量、改善循環(huán)灌注的同時(shí),也可提升血管重建術(shù)后的長期通暢率。然后,研究表明成熟的VECs在病例生理情況下存在活性低,生長緩,更新慢等缺陷,極大程度的限制了在臨床治療中的應(yīng)用。因此,如何賦予VECs抗凋亡、促增值、易遷移等特征為目前動(dòng)脈硬化治療急需解決的一大難題。生存素(Survivin,SVV)為 LAP(inhibitors of apoptosis protein)家族中分子量最小的成員,可與多種細(xì)胞周期及分裂相關(guān)蛋白如INCENP、Aurora B、CyclinD等發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)從而提升細(xì)胞生存率。同時(shí),SVV也能通過caspase依賴與非依賴細(xì)胞凋亡途徑抑制細(xì)胞死亡過程。目前研究推測(cè)SVV可與caspase 3的感受器或效應(yīng)器結(jié)合從而抑制細(xì)胞凋亡[1],也有報(bào)道指出SVV可直接與caspase 9結(jié)合抑制其凋亡活性[2]。最新研究表明SVV不僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上升,在人胚胎干細(xì)胞與多種體干細(xì)胞中也有顯著表達(dá),同時(shí)在未分化成熟的鱗狀上皮、粘膜上皮細(xì)胞中也可檢測(cè)到SVV表達(dá),如食管上皮細(xì)胞、胃粘膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞等[3,4],參與調(diào)控此類細(xì)胞對(duì)于內(nèi)環(huán)境變化的所做出的相應(yīng)反應(yīng)并決定細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。SVV作為腫瘤非特異性基因,對(duì)細(xì)胞分化與凋亡調(diào)節(jié)有關(guān)鍵作用,在體內(nèi)受到嚴(yán)格的調(diào)控,通常不參與細(xì)胞的腫瘤樣變。本研究驗(yàn)證內(nèi)皮細(xì)胞中SVV的表達(dá)情況,通過上調(diào)SVV的表達(dá)探討其基因多效性對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增值及凋亡等生物活性的影響,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步分析,同時(shí)體內(nèi)驗(yàn)證內(nèi)皮細(xì)胞中SVV基因?qū)ρ苄律淖饔?為周圍血管疾病的基因靶向治療奠定相應(yīng)理論基礎(chǔ)。第一部分內(nèi)皮細(xì)胞中Suvivin基因的驗(yàn)證目的:驗(yàn)證內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin基因的表達(dá)情況方法:收集對(duì)數(shù)期生長的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞,采用真核細(xì)胞裂解液按照說明提取內(nèi)皮細(xì)胞蛋白,通過western-blot及RT-PCR驗(yàn)證大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin基因(BIRC-5)在蛋白和核酸水平的表達(dá)情況。結(jié)果:western-blot結(jié)果顯示各組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞在蛋白水平均可見Survivin蛋白表達(dá),灰度值為70.45±3.586;同時(shí)RT-PCR結(jié)果提示BIRC-5在正常大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá),2-ΔΔCt為0.83±0.045。結(jié)論:Survivin蛋白及其編碼基因BIRC-5在正常大鼠血管中均存在低表達(dá)。第二部分通過腺病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin 基因目的:上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin基因?yàn)槠涠嘈匝芯繕?gòu)建理想細(xì)胞模型方法:構(gòu)建攜帶目的基因(BIRC-5)及綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的腺病毒載體,通過 MOI 梯度(100MOI、200MOI、300MOI)轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞,在24h、48h熒光倒置顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況,摸索最適MOI。并通過western-blot及RT-PCR從蛋白及核酸水平驗(yàn)證Survivin基因的上調(diào)情況。結(jié)果:不同MOI轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,各組細(xì)胞在24、48h熒光強(qiáng)度呈遞增趨勢(shì),且300MOI24h轉(zhuǎn)染效率最佳,可達(dá)95%,western-blot結(jié)果顯示300MOI轉(zhuǎn)染組Survivin蛋白表達(dá)相應(yīng)升高。PT-PCR結(jié)果顯示BIRC-5較對(duì)照組顯著升高。結(jié)論:Ad-GPF/SVV具有較高的轉(zhuǎn)染率,對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin基因表達(dá)有顯著的提升第三部分體外驗(yàn)證Survivin基因多效性對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及其機(jī)制的研究目的:證實(shí)上調(diào)Survivin基因可使內(nèi)皮細(xì)胞獲得促增值、抗凋亡、易侵襲等生物活性并驗(yàn)證其調(diào)控靶點(diǎn)方法:Ad-GFP/SVV于300MOI轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞,24小時(shí)后通過流式細(xì)胞儀、CCK-8、transwell試劑盒體外檢測(cè)過表達(dá)Survivin基因內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、增殖及侵襲活性變化,采用western-blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D及與survivin交聯(lián)組成CPC的染色體過客蛋白INCENP及Aurora B蛋白及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、bcl-2。通過RT-PCR 檢測(cè) Caspase-3、bcl-2 mRNA 的變化,ELISA 檢測(cè) MMP-2、MMP-9、Ang-2分泌情況。結(jié)果:上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin基因后其增值活性較對(duì)照組明顯增加,細(xì)胞周期蛋白CyclinD及有絲分裂調(diào)控蛋白INCENP、AuroraB及磷酸化Aurora B表達(dá)水平相應(yīng)提升,同時(shí),Survivin基因過表達(dá)提升內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡能力,并從核酸和蛋白水平促進(jìn)了 bcl-2的表達(dá),抑制Caspase-3的表達(dá)從而失活了其介導(dǎo)的凋亡通路。內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin基因表達(dá)提升同樣促進(jìn)了其侵襲能力,分泌MMP-2、MMP-9、Ang-2較對(duì)照顯著增加。結(jié)論:大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中Survivin的上調(diào)對(duì)其增殖,抗凋亡及侵襲能力均有顯著的影響。一定程度克服了其生理情況下生物活性低的缺陷。第四部分體內(nèi)證實(shí)Survivin基因多效性促進(jìn)新生血管生成目的:體內(nèi)驗(yàn)證上調(diào)Survivin基因促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力方法:通過肌肉注射將過表達(dá)Survivin基因的RAECs移植于裸鼠下肢肌肉組織中,2周后取組織以石蠟及冰凍切片,采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD31陽性的內(nèi)皮細(xì)胞并計(jì)算新生微血管數(shù)量。同時(shí),HE染色驗(yàn)證細(xì)胞異性型,排除其腫瘤樣變。通過熒光雙標(biāo)檢測(cè)新生微血管中CD31、Survivin 的表達(dá)。結(jié)果:細(xì)胞移植兩周后,Survivin過表達(dá)組新生微血管數(shù)較對(duì)照組明顯增加。HE染色各組均未見內(nèi)皮細(xì)胞核形態(tài)異常,核質(zhì)比例增大等腫瘤樣變性,實(shí)驗(yàn)組新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin見顯著表達(dá)。結(jié)論:構(gòu)建的增殖型腺病毒通過提升內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin基因的表達(dá),改變其生物活性從而獲得較強(qiáng)的血管新生能力,并一定程度抵消了同種異體排除反應(yīng)。
【圖文】：

為明確ＲＡＥＣｓ中ＢＩＲＣ－５基因轉(zhuǎn)錄水平，將多組培養(yǎng)細(xì)胞（生長至８０％－９０％）逡逑進(jìn)行ＲＮＡ提取，逆轉(zhuǎn)錄生成ｃＤＮＡ，并進(jìn)行ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)３次，逡逑取平均值，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的ＲＡＥＣｓ中，ＢＩＲＣ－５轉(zhuǎn)錄均為陽性（附圖２），且逡逑轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較低，２－ＡＡＧｔ邋Ｓ邋０．８３±０．０４５。逡逑｜逡逑Ｕｎｌｌ逡逑＂Ｂ邋Ｏ－Ｏ１邐ｌ邐ｆ邐Ｉ逡逑｜邐ＮＵＲＡＥＣｓ邋ＮＩ－ＲＡＥＣｓ邋ＮＩ－ＲＡＥＣｓ逡逑圖２大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ邋ｍＲＮＡ的相對(duì)表達(dá)水平逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｓｕｒｖｉｖｉｎ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ＲＥＡＣｓ逡逑３討論逡逑Ｓｕｒｖｉｖｉｎ為ＩＡＰ家族中分子量最小成員，蛋白分子量僅為１６＿５ｋＤａ，同時(shí)也被成逡逑為復(fù)合蛋白邋５邋重復(fù)序列（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ邋ＬＡＰ邋ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋５，邋ＢＩＲＣ－５），是目逡逑前已知的最強(qiáng)的抗凋亡因子，參與細(xì)胞周期Ｇ２／Ｍ期及細(xì)胞抗凋亡的調(diào)控［７］。在有逡逑絲分裂過程中，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白可通過細(xì)胞周期蛋白ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＣ２、逡逑ＣＤＫ９［８］以及與有絲分裂效應(yīng)器直接關(guān)聯(lián)，在參與調(diào)解有絲分裂各階段微管結(jié)構(gòu)的逡逑穩(wěn)定及降解的同時(shí)，也可特異性參與Ｇ１期向Ｓ期的調(diào)控［９］，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。目逡逑前普遍認(rèn)為

２．２邋Ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白及基因表達(dá)水平的檢驗(yàn)逡逑Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ邋結(jié)果顯示邋Ａｄ－ＧＦＰ／ＳＷ邋以邋３００ＭＯＩ、２４ｈ邋轉(zhuǎn)染后，，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ邋蛋白表逡逑達(dá)相應(yīng)提升，見圖３ａ，用ｉｍｎａｇｅＪ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算出ＣＯＮ組ＳＷ蛋逡逑白表達(dá)量為邋７４．６０士２．５５０，邋１Ｎ邋組為邋８０．４２士３．４５９，邋Ａｄ－ＧＦＰ／ＳＷ邋組為邋１７４．５０±１２．６３０，逡逑單因素方差分析結(jié)果提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（尸＜０．０５），組間兩兩比較采用ＬＳＤ－ｔ逡逑檢驗(yàn)，Ａｄ－ＧＦＰ／ＳＷ組ＳＷ蛋白較ＩＮ組增高（尸＝０．０００），同時(shí)較ＣＯＮ組也相應(yīng)逡逑升高００．０００）邋，］Ｎ組與ＣＯＮ組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（尸＞０．０５）。ＲＴ－ＰＣＲ檢逡逑測(cè)得到各組基因Ｃｔ值，目的基因ＢＩＣＲ－５邋ｍＲＮＡ與內(nèi)參基因ＧＡＤＰＨ的擴(kuò)增效果逡逑一致，可運(yùn)用２＿ＡＡｃｔ法計(jì)算各組細(xì)胞中ＢＩＲＣ－５基因的轉(zhuǎn)錄量相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)基因轉(zhuǎn)錄逡逑量的倍數(shù)，計(jì)算得ＩＮ組ＢＩＲＣ－５基因的轉(zhuǎn)錄量為０．９３±０．３０７，ＣＯＮ組為１．０５±０．２１６，逡逑Ａｄ－ＧＦＰ／ＳＷ邋組為邋２．００３±０．３２１
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王學(xué)虎;傅仲學(xué);諶偉;吳星燁;;VEGF上調(diào)不同類型細(xì)胞Survivin的表達(dá)[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2009年12期

本文編號(hào)：2604482