【摘要】：為了研究河南華溪蟹卵子發(fā)生的細(xì)胞分子機(jī)制,本學(xué)位論文通過組織學(xué)觀察,追蹤了卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的過程,詳細(xì)描述了卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的細(xì)胞學(xué)規(guī)律。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合前期獲得的河南華溪蟹vasa生殖標(biāo)記基因的序列,分析并揭示了vasa基因和蛋白的時(shí)空表達(dá)特征。研究主要包括三個(gè)部分:1.河南華溪蟹卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的組織學(xué)分析本文通過組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)觀察對(duì)河南華溪蟹卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的細(xì)胞學(xué)規(guī)律進(jìn)行了研究。依據(jù)卵母細(xì)胞的形狀和大小、卵黃顆粒的形成和積累及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),將卵子發(fā)生的過程分為四個(gè)時(shí)期,卵巢發(fā)育過程分為六個(gè)時(shí)期。卵子發(fā)生過程包括卵原細(xì)胞期、卵黃發(fā)生早期、卵黃發(fā)生期、成熟期,進(jìn)一步分為六個(gè)時(shí)相,其中卵黃發(fā)生早期包括第一時(shí)相卵母細(xì)胞(OI)和第二時(shí)相卵母細(xì)胞(OII),卵黃發(fā)生期包括第三時(shí)相卵母細(xì)胞(OIII)、第四時(shí)相卵母細(xì)胞(OIV)和第五時(shí)相卵母細(xì)胞(OV),成熟期即第六時(shí)相卵母細(xì)胞(OVI)。卵巢發(fā)育過程包括增殖期、小生長期、大生長期、近成熟期、成熟期和恢復(fù)期,并且不同發(fā)育時(shí)期的卵巢的顏色和大小均存在顯著差異。研究表明,卵母細(xì)胞的發(fā)育是不同步的,在不同發(fā)育時(shí)期的卵巢中同時(shí)存在兩個(gè)或兩個(gè)以上發(fā)育時(shí)相的卵母細(xì)胞。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)和分析性腺指數(shù)可知卵巢的發(fā)育周期與季節(jié)密切相關(guān),追蹤發(fā)現(xiàn)河南華溪蟹的繁殖季節(jié)為每年5月至6月。2.河南華溪蟹VASA蛋白的原核表達(dá)、抗體制備及免疫鑒定本文選取河南華溪蟹vasa基因的特異區(qū)段,成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a-Shvasa。通過SDS-PAGE檢測(cè),完成了VASA融合蛋白的表達(dá),獲得了大量在菌液上清中約47 kDa的可溶性的VASA融合蛋白,制備了河南華溪蟹VASA蛋白的多克隆抗體。通過ELISA檢測(cè),表明河南華溪蟹VASA多克隆抗體的效價(jià)高達(dá)1:10~5。進(jìn)一步進(jìn)行免疫吸附和Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定了抗體特異性,結(jié)果表明獲得的多克隆抗體不僅識(shí)別VASA融合蛋白而且特異性識(shí)別河南華溪蟹卵巢中的天然VASA。3.河南華溪蟹vasa基因和蛋白在卵子發(fā)生過程中的表達(dá)模式本文通過SqRT-PCR檢測(cè)了不同發(fā)育時(shí)期卵母細(xì)胞中vasa基因的表達(dá)。結(jié)果顯示vasa在卵原細(xì)胞期和卵黃發(fā)生早期的表達(dá)量較高,在卵黃發(fā)生中期(OIV)vasa基因的表達(dá)量開始下降,并隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟,vasa基因的表達(dá)量逐漸下降。通過Western Blot檢測(cè)了VASA蛋白的組織分布,揭示了VASA蛋白在卵巢和精巢組織中特異表達(dá)。進(jìn)一步通過熒光免疫組化方法,觀察了不同發(fā)育時(shí)期的卵母細(xì)胞中VASA蛋白的動(dòng)態(tài)分布。研究表明,在卵原細(xì)胞中VASA蛋白均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中,卵黃發(fā)生早期(OI和OII)VASA蛋白在細(xì)胞質(zhì)中分布,同時(shí)逐漸向細(xì)胞核周圍匯集,卵黃發(fā)生前期和中期(OIII和OIV)VASA蛋白主要分布在細(xì)胞核周圍,卵黃發(fā)生中期(OIV)VASA蛋白的信號(hào)減弱。本文通過對(duì)河南華溪蟹卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的細(xì)胞學(xué)規(guī)律的研究,及對(duì)相關(guān)發(fā)育時(shí)期的劃分和特征描述,為十足動(dòng)物生殖生物學(xué)提供了數(shù)據(jù)資料。在此基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步研究河南華溪蟹的生殖發(fā)育的分子機(jī)制,研究選用了生殖標(biāo)記基因vasa,通過對(duì)VASA蛋白特異性多克隆抗體的制備及其表達(dá)特征的研究,為鑒定河南華溪蟹及其他蟹類的生殖細(xì)胞提供了有效手段,對(duì)進(jìn)一步解析十足動(dòng)物VASA蛋白的功能和卵子發(fā)生的調(diào)控機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 長江華溪蟹雌性生殖系統(tǒng)[5] The female reproductive system of Sinopotamon1.2 伊朗陸溪蟹纖維肌性卵巢囊（Cap）的橫截面包含 oogonia（Oog）和初級(jí)卵母細(xì)胞（pOc）的1，Oc2），卵黃發(fā)生卵母細(xì)胞（Oc3，Oc4）和卵子發(fā)生囊（Op）；中央卵巢腔（Lc）rawing of cross section of an ovarian sac of S. iran

1.2 伊朗陸溪蟹纖維肌性卵巢囊（Cap）的橫截面包含 oogonia（Oog）和初級(jí)卵母細(xì)胞（pOc）的1，Oc2），卵黃發(fā)生卵母細(xì)胞（Oc3，Oc4）和卵子發(fā)生囊（Op）；中央卵巢腔（Lc）rawing of cross section of an ovarian sac of S. iranvarian epithelium (Ep); germinal zone (Gz) cont oogenesis pouches (Op) containing previtellog, Oc4) and mature oocytes (mOc); central ovarian l征如顏色變化是不同物種進(jìn)行卵巢分期的并且隨著卵巢的不斷發(fā)育，卵巢顏色不斷不同的蟹中，卵巢顏色變化的趨勢(shì)是相似巢變化更為顯著，，跨度更大。發(fā)生的研究動(dòng)態(tài)
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2604285