【摘要】：為了研究河南華溪蟹卵子發(fā)生的細胞分子機制,本學位論文通過組織學觀察,追蹤了卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的過程,詳細描述了卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的細胞學規(guī)律。在此基礎上,結(jié)合前期獲得的河南華溪蟹vasa生殖標記基因的序列,分析并揭示了vasa基因和蛋白的時空表達特征。研究主要包括三個部分:1.河南華溪蟹卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的組織學分析本文通過組織學和細胞學觀察對河南華溪蟹卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的細胞學規(guī)律進行了研究。依據(jù)卵母細胞的形狀和大小、卵黃顆粒的形成和積累及細胞核和細胞質(zhì),將卵子發(fā)生的過程分為四個時期,卵巢發(fā)育過程分為六個時期。卵子發(fā)生過程包括卵原細胞期、卵黃發(fā)生早期、卵黃發(fā)生期、成熟期,進一步分為六個時相,其中卵黃發(fā)生早期包括第一時相卵母細胞(OI)和第二時相卵母細胞(OII),卵黃發(fā)生期包括第三時相卵母細胞(OIII)、第四時相卵母細胞(OIV)和第五時相卵母細胞(OV),成熟期即第六時相卵母細胞(OVI)。卵巢發(fā)育過程包括增殖期、小生長期、大生長期、近成熟期、成熟期和恢復期,并且不同發(fā)育時期的卵巢的顏色和大小均存在顯著差異。研究表明,卵母細胞的發(fā)育是不同步的,在不同發(fā)育時期的卵巢中同時存在兩個或兩個以上發(fā)育時相的卵母細胞。進一步統(tǒng)計和分析性腺指數(shù)可知卵巢的發(fā)育周期與季節(jié)密切相關,追蹤發(fā)現(xiàn)河南華溪蟹的繁殖季節(jié)為每年5月至6月。2.河南華溪蟹VASA蛋白的原核表達、抗體制備及免疫鑒定本文選取河南華溪蟹vasa基因的特異區(qū)段,成功構(gòu)建了原核表達載體pET32a-Shvasa。通過SDS-PAGE檢測,完成了VASA融合蛋白的表達,獲得了大量在菌液上清中約47 kDa的可溶性的VASA融合蛋白,制備了河南華溪蟹VASA蛋白的多克隆抗體。通過ELISA檢測,表明河南華溪蟹VASA多克隆抗體的效價高達1:10~5。進一步進行免疫吸附和Western blot實驗鑒定了抗體特異性,結(jié)果表明獲得的多克隆抗體不僅識別VASA融合蛋白而且特異性識別河南華溪蟹卵巢中的天然VASA。3.河南華溪蟹vasa基因和蛋白在卵子發(fā)生過程中的表達模式本文通過SqRT-PCR檢測了不同發(fā)育時期卵母細胞中vasa基因的表達。結(jié)果顯示vasa在卵原細胞期和卵黃發(fā)生早期的表達量較高,在卵黃發(fā)生中期(OIV)vasa基因的表達量開始下降,并隨著卵母細胞的發(fā)育成熟,vasa基因的表達量逐漸下降。通過Western Blot檢測了VASA蛋白的組織分布,揭示了VASA蛋白在卵巢和精巢組織中特異表達。進一步通過熒光免疫組化方法,觀察了不同發(fā)育時期的卵母細胞中VASA蛋白的動態(tài)分布。研究表明,在卵原細胞中VASA蛋白均勻分布于細胞質(zhì)中,卵黃發(fā)生早期(OI和OII)VASA蛋白在細胞質(zhì)中分布,同時逐漸向細胞核周圍匯集,卵黃發(fā)生前期和中期(OIII和OIV)VASA蛋白主要分布在細胞核周圍,卵黃發(fā)生中期(OIV)VASA蛋白的信號減弱。本文通過對河南華溪蟹卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的細胞學規(guī)律的研究,及對相關發(fā)育時期的劃分和特征描述,為十足動物生殖生物學提供了數(shù)據(jù)資料。在此基礎上,為進一步研究河南華溪蟹的生殖發(fā)育的分子機制,研究選用了生殖標記基因vasa,通過對VASA蛋白特異性多克隆抗體的制備及其表達特征的研究,為鑒定河南華溪蟹及其他蟹類的生殖細胞提供了有效手段,對進一步解析十足動物VASA蛋白的功能和卵子發(fā)生的調(diào)控機制提供了分子基礎。
【圖文】：

圖 1.1 長江華溪蟹雌性生殖系統(tǒng)[5] The female reproductive system of Sinopotamon1.2 伊朗陸溪蟹纖維肌性卵巢囊（Cap）的橫截面包含 oogonia（Oog）和初級卵母細胞（pOc）的1，Oc2），卵黃發(fā)生卵母細胞（Oc3，Oc4）和卵子發(fā)生囊（Op）；中央卵巢腔（Lc）rawing of cross section of an ovarian sac of S. iran

1.2 伊朗陸溪蟹纖維肌性卵巢囊（Cap）的橫截面包含 oogonia（Oog）和初級卵母細胞（pOc）的1，Oc2），卵黃發(fā)生卵母細胞（Oc3，Oc4）和卵子發(fā)生囊（Op）；中央卵巢腔（Lc）rawing of cross section of an ovarian sac of S. iranvarian epithelium (Ep); germinal zone (Gz) cont oogenesis pouches (Op) containing previtellog, Oc4) and mature oocytes (mOc); central ovarian l征如顏色變化是不同物種進行卵巢分期的并且隨著卵巢的不斷發(fā)育，卵巢顏色不斷不同的蟹中，卵巢顏色變化的趨勢是相似巢變化更為顯著，，跨度更大。發(fā)生的研究動態(tài)
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2604285