【摘要】：目的:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是普遍存在于老年人中的神經(jīng)退行性疾病,其典型癥狀是進行性的認知和記憶功能損害,同時伴有不同程度的步態(tài)紊亂。Aβ(amyloidβ)一直被認為是AD免疫治療的重要靶點。目前關(guān)于Aβ免疫治療的研究很多,但多集中在藥物對抗認知功能損害或情緒變化等方面,而關(guān)于藥物對AD異常步態(tài)的相關(guān)作用卻還未見報道。單鏈可變抗體片段(single chain variable domain antibody fragment 17,scFv17)是針對Aβ_(31-35)5個氨基酸序列作用的單鏈可變片段,能夠明顯清除腦內(nèi)Aβ沉積,改善認知功能。本研究將利用PS1M146V/APPswe/tauP301L(3xTg-AD)三轉(zhuǎn)基因小鼠,采用步態(tài)行為學(xué)實驗方法,觀察慢性鼻飼給予scFv17對3xTg-AD小鼠步態(tài)行為的影響。并在此基礎(chǔ)上,我們采用多種形態(tài)學(xué)方法,觀察給予scFv17后小腦相關(guān)腦區(qū)的病理學(xué)變化,以進一步闡明scFv17改善小鼠步態(tài)行為的可能的病理學(xué)機制,為AD治療提供新的實驗策略及依據(jù)。方法:本實驗首先選用6月齡3xTg-AD小鼠和C57BL/6野生型小鼠,觀察記錄它們的步態(tài)行為,在12月齡時發(fā)現(xiàn)3xTg-AD小鼠的步態(tài)嚴重受損后,將上述兩種小鼠隨機分為野生型對照組(WT+PBS)、野生型給藥組(WT+scFv17)、3xTg-AD對照組(3xTg-AD+PBS)以及3xTg-AD小鼠給藥組(3xTg-AD+scFv17)四組。采用鼻飼方法,每次給予每只小鼠20μl的scFv17(1.5mg/kg)或者等體積的PBS(0.01M),每周兩次,連續(xù)給藥12周后進行步態(tài)行為測試及小腦病理學(xué)檢測。1.步態(tài)分析讓小鼠自由、無停頓、無干擾地通過步態(tài)分析儀的跑道,同時利用高速攝像機記錄30cm長度范圍內(nèi)小鼠足部信息,經(jīng)特定分析軟件分析后獲得步態(tài)參數(shù),包括站立時間百分比(Stance Time Percent)、搖擺時間百分比(Swing Time Percent)、后爪步幅寬度(Rear Track Width),以判斷各組小鼠的運動平衡和協(xié)調(diào)能力。2.病理學(xué)檢測小鼠經(jīng)心臟灌注、取腦后,矢狀面朝下石蠟包埋保存,之后經(jīng)切片、攤片、烤片后,進行以下實驗:(1)HE染色實驗觀察小腦蚓部的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。(2)尼氏染色實驗觀察小腦蚓部浦肯野細胞的胞漿尼氏體損傷以及scFv17對其的改善作用。(3)石蠟免疫組化實驗經(jīng)過烘烤的小腦切片在經(jīng)過脫蠟,蒸餾水洗后,按照熱抗原修復(fù)→滅活內(nèi)源性過氧化物酶→血清封閉→一抗孵育→二抗孵育→辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素三抗處理→顯色→終止顯色→蘇木素復(fù)染→脫水→透明→封片的步驟完成實驗,后經(jīng)Scanscope數(shù)字病理切片掃描成像系統(tǒng)掃描、截圖后,觀察分析比較各組小鼠小腦蚓部皮層Aβ斑塊(6E10)的分布,浦肯野細胞(Purkinje cells,PCs)內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)(AT8)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)及其高親和力受體TrkB,以及分子層突觸素(synaptophysin)的表達情況,探究scFv17對小腦相關(guān)病理變化的改善作用。結(jié)果:1.步態(tài)實驗中,我們發(fā)現(xiàn),(1)與同月齡WT組小鼠(P㩳0.001),6月和9月齡3xTg-AD小鼠(P㩳0.001)相比,12月齡3xTg-AD小鼠后爪步幅寬度明顯增寬;12月齡3xTg-AD小鼠相比同月齡WT組小鼠(P㩳0.001)、6月和9月齡的3xTg-AD小鼠(P㩳0.001)站立時間百分比更大,搖擺時間百分比更小。(2)與野生型對照組小鼠相比較,3xTg-AD對照組小鼠的后爪步幅寬度明顯增寬(P㩳0.001);野生型給藥組小鼠的后爪步幅寬度與野生型對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P㧐0.05),但3xTg-AD給藥組的后爪步幅寬度明顯小于3xTg-AD對照組(P㩳0.05)。(3)3xTg-AD對照組小鼠相比野生型對照組,站立時間百分比明顯增大(P㩳0.001),而搖擺時間百分比明顯減小(P㩳0.001);野生型給藥組的兩個時間百分比參數(shù)與野生型對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P㧐0.05),但經(jīng)scFv17治療后3xTg-AD給藥組小鼠站立時間百分比明顯小于3xTg-AD對照組(P㩳0.01),其搖擺時間百分比明顯大于3xTg-AD對照組(P㩳0.001)。2.HE染色實驗中,野生型給藥組和野生型對照組小鼠的小腦浦肯野細胞排列整齊密集,細胞結(jié)構(gòu)清晰,胞漿紅染胞核藍染,胞核圓形或橢圓形,核仁清晰,形態(tài)正常;3xTg-AD對照組小鼠的小腦浦肯野細胞排列比較稀疏,輪廓模糊,凋亡細胞多,經(jīng)scFv17治療后的3xTg-AD治療組小鼠細胞凋亡程度輕,形態(tài)較3xTg-AD+PBS組小鼠有所改善。3.尼氏染色實驗中,3xTg-AD對照組與野生型對照組相比,尼氏染色陽性浦肯野細胞密度明顯降低(P㩳0.001);野生型治療組與野生型對照組相比,細胞密度沒有顯著性差異(P㧐0.05),但scFv17明顯上調(diào)了3xTg-AD治療組浦肯野細胞的數(shù)目(P㩳0.001)。4.石蠟免疫組化中,(1)與野生型對照組相比,3xTg-AD對照組Aβ斑塊數(shù)量明顯增多(P㩳0.001),而慢性鼻飼scFv17后,3xTg-AD治療組小腦皮層內(nèi)Aβ斑塊沉積相比3xTg-AD對照組明顯減少(P㩳0.001);(2)相對于野生型對照組,3xTg-AD對照組小腦蚓部PCs內(nèi)存在大量的NFT(P㩳0.001),而單鏈抗體治療組3xTg-AD+scFv17組PCs內(nèi)NFT相比3xTg-AD對照組大幅度減少(P㩳0.01);(3)3xTg-AD對照組與野生型對照組相比,PCs層的BNDF表達量明顯降低(P㩳0.001),3xTg-AD給藥組PCs層的BNDF表達量相比3xTg-AD對照組明顯增多(P㩳0.001);(4)野生型對照組和野生型給藥組之間PCs層的Trk-B表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(P㧐0.05),但是與野生型對照組相比,3xTg-AD對照組其表達量明顯減少(P㩳0.001),3xTg-AD給藥組Trk-B表達量相比3xTg-AD對照組增多(P㩳0.001);(5)3xTg-AD對照組小腦蚓部分子層突觸素陽性顆粒的相對光密度值明顯低于野生型對照組(P㩳0.001),而3xTg-AD給藥組的明顯升高(P㩳0.001)。結(jié)論:1.12月齡3xTg-AD小鼠運動協(xié)調(diào)和平衡能力嚴重受損。scFv17改善了12月齡3xTg-AD小鼠運動協(xié)調(diào)和平衡能力。2.scFv17改善了3xTg-AD小鼠小腦蚓部浦肯野細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),減輕了浦肯野細胞的損傷。3.scFv17減少了3xTg-AD小鼠小腦蚓部皮層內(nèi)Aβ斑塊,浦肯野細胞層內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)。4.scFv17增加了3xTg-AD小鼠小腦蚓部浦肯野細胞層內(nèi)BDNF及Trk-B受體的表達量,同時增加了分子層內(nèi)synaptophysin的蛋白表達量�？傊�,scFv17明顯改善了3xTg-AD小鼠的步態(tài)行為,其機制可能是scFv17清除了小腦蚓部皮層內(nèi)Aβ斑塊和NFT,繼而減輕了小腦PCs的病理損傷,提示scFv17有望成為治療AD異常步態(tài)及小腦損傷的一種新策略。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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1 張勝威;董世芬;武汀;靳洪濤;孫建寧;;APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠認知功能和實時步態(tài)行為的相關(guān)性[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2014年05期

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 蘇立達;小腦浦肯野細胞長時程突觸可塑性若干分子機制的研究[D];浙江大學(xué);2009年

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本文編號：2603909