【摘要】：葉片衰老是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,通常發(fā)生在植物發(fā)育的最后階段,由環(huán)境信號(hào)和多基因網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)控。類病變突變體能自發(fā)形成類似于過敏反應(yīng)的壞死斑,且大多數(shù)突變體能表現(xiàn)出對(duì)一種或多種病原菌的抗性,是一類研究植物防御反應(yīng)機(jī)制的理想材料。盡管目前對(duì)植物葉片衰老和防御反應(yīng)的分子機(jī)理有了一定的研究,但其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍有待進(jìn)一步豐富和解讀,從而為開展水稻分子設(shè)計(jì)育種,培育抗衰老高產(chǎn)新品種打下基礎(chǔ)。本研究通過EMS誘變粳稻品種云稻32(Y32)種子獲得兩個(gè)穩(wěn)定遺傳的類病變?cè)缢ネ蛔凅w,分別命名為:lmes3(lesion mimic and early senescence 3)和 lmes4(lesion mimic and early senescence 4)。經(jīng)表型鑒定、基因定位與克隆、抗性鑒定及功能分析等相關(guān)研究,主要結(jié)果如下:1、lmes3突變體苗期地上部表現(xiàn)正常,但根系發(fā)育受阻;分蘗早期葉片就出現(xiàn)鐵銹斑表型,隨著植株的生長,斑點(diǎn)數(shù)目增加;進(jìn)入孕穗期,葉尖開始枯黃,出現(xiàn)早衰表型;抽穗期枯黃從葉尖開始沿著葉邊一直延續(xù)到葉的底部;成熟期斑點(diǎn)連片存在,衰老加速,葉片全部枯黃,整個(gè)植株呈黃褐色直至提前枯死。在苗期和分蘗期對(duì)植株進(jìn)行低溫處理時(shí),能誘導(dǎo)lmes3突變體表現(xiàn)出早衰現(xiàn)象。lmes4突變體苗期地上部也表現(xiàn)正常,在分蘗早期葉片出現(xiàn)類似于過敏反應(yīng)(hypersensitive response,HR)的類病斑,同時(shí)整片葉片葉脈間的葉肉部分出現(xiàn)失綠黃化癥狀,而葉脈仍然保持綠色;到抽穗期時(shí),突變體下部葉片葉尖枯黃加劇,上部功能葉片葉尖開始枯黃并伴有水漬狀斑點(diǎn),整片葉片葉脈間的失綠黃化癥加重;成熟期葉尖完全枯黃,葉脈間黃化癥連片出現(xiàn),并從葉尖一直延續(xù)到葉中部,直到整片葉片三分之一以上完全枯死;成熟后20d,突變體葉尖完全枯死,但整片葉片還有部分保持綠色,葉片表現(xiàn)為過早衰老。與野生型相比,lmes3突變體的抽穗期晚3d,lmes4突變體的抽穗期晚2d,lmes3和lmes4突變體的株高、結(jié)實(shí)率及千粒重均顯著性降低,而穗長、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)差異不明顯。2、遺傳分析表明,lmes3和lmes4突變表型均受單隱性核基因控制。利用圖位克隆法,最終將LMES3基因定位在第5染色體P27和P33之間約55kb的物理區(qū)間內(nèi);將LMES4基因定位在第1染色體M25和M48之間約48kb的物理區(qū)間內(nèi)。通過RGAP(Rice Genome Annotation Project)網(wǎng)站上的注釋查詢,發(fā)現(xiàn)LMES3基因定位的區(qū)間包含8個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF),測(cè)序發(fā)現(xiàn)第2開放閱讀框上發(fā)生一個(gè)G到A的單堿基突變,造成了編碼的氨基酸由谷氨酸(Glu)替換成了賴氨酸(Lys),經(jīng)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其就是LMES3的候選基因。LMES4基因定位的區(qū)間包含7個(gè)開放閱讀框,測(cè)序發(fā)現(xiàn)第6開放閱讀框上發(fā)生一個(gè)G到A的單堿基突變,造成編碼氨基酸由色氨酸(Try)替換成了終止子,導(dǎo)致翻譯提前終止,最終造成蛋白質(zhì)功能缺失。3、LMES3和LMES4為兩個(gè)未報(bào)道控制葉片早衰的新基因。組織特異表達(dá)分析表明LMES3基因在各個(gè)組織器官均有表達(dá),其中在莖中表達(dá)量最高。亞細(xì)胞定位分析表明,LEMS3蛋白最終定位于細(xì)胞膜上。4、葉綠素含量的下降是葉片衰老的重要生理指標(biāo)。相關(guān)測(cè)定結(jié)果顯示,lmes3和lmes4突變體葉片中葉綠素的含量較野生型均顯著下降,這表明兩個(gè)突變體在生理水平上均已經(jīng)開始早衰。衰老誘導(dǎo)的SGR(STAY GREEN)基因在調(diào)節(jié)葉綠素降解代謝的過程中發(fā)揮著重要的作用,而 qRT-PCR(quantitative real-time,PCR)也證明 SCG 在lmes3和lmes4突變體的葉片中的表達(dá)量均顯著上調(diào)。此外,lmes3和lmes4突變體的離體葉片在黑暗誘導(dǎo)下均比野生型衰老更為迅速和劇烈,這表明LMES3和LMES4基因的突變加快了葉片衰老。5、葉肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)顯示,lmes3和lmes4突變體的葉綠體中類囊體排列比較紊亂,片層排列不規(guī)則,嗜鋨顆粒的數(shù)量增多,體積增大,顏色加深,且lmes4中葉綠體數(shù)目有所減少。這些結(jié)果表明LMES3和LMES4基因突變影響了葉綠體的發(fā)育,從而導(dǎo)致葉綠素含量顯著下降,葉片提前衰老。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)lmes4葉片單位葉面積內(nèi)氣孔和周邊排列的硅質(zhì)化爪狀突起的數(shù)目減少,表明其水分蒸騰作用下降,推測(cè)一些隨水份吸收和流動(dòng)的礦質(zhì)鹽類(無機(jī)鹽)運(yùn)輸減弱,進(jìn)而導(dǎo)致葉片正常生理活動(dòng)受阻,造成葉片早衰。6、組織化學(xué)染色表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)——超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)在lmes3和lmes4突變體葉片中積累,葉片丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增加,這些結(jié)論充分表明lmes3和lmes4突變體葉片已經(jīng)發(fā)生早衰。為了探索lmes3和lmes4突變體中ROS的代謝過程,檢測(cè)了野生型和突變體中抗氧化酶過氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)的酶學(xué)活性,其中POD和SOD活性在lmes3和lmes4突變體的葉片中顯著升高,而CAT活性則顯著降低。POD和SOD活性的升高表明lmes3和lmes4突變體可能在積極地響應(yīng)H2O2和O2-的積累,而lmes3和lmes4突變體葉片中CAT活性的降低可能不足以清除這些額外的H2O2,致使H2O2大量積累。積累的ROS在lmes3和lmes4突變體的葉片早衰和防御反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用。7、qRT-PCR分析表明,在lmes3和lmes4突變體葉片中,衰老相關(guān)的標(biāo)志基因Osl2和Osl85,相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY23和OsNAC2表達(dá)均上調(diào),光合系統(tǒng)相關(guān)基因rbcS、lhcA、lhcB表達(dá)均下調(diào)。這些結(jié)果在分子水平上證實(shí)了 lmes3和lmes4突變體的葉片發(fā)生了早衰。8、接種白葉枯病菌浙173(Z173)后,野生型Y32植株表現(xiàn)出典型的白葉枯病發(fā)病癥狀,而突變體植株卻顯著提高了對(duì)白葉枯病的抗性。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)防御反應(yīng)相關(guān)基因PR1a、PBZ1和OsWRKY45的表達(dá)量在lmes3和lmes4突變體葉片中均顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明,LMES3和LMES4基因突變可激活植株防御反應(yīng),進(jìn)而增強(qiáng)抗白葉枯病的能力。上述結(jié)果表明LMES3和LMES4基因突變可導(dǎo)致葉片早衰和防御反應(yīng)的產(chǎn)生,ROS(02-和H2O2)可能參與了這兩個(gè)生物學(xué)過程。其中,水稻LMES3的編碼蛋白是一個(gè)多功能蛋白,在葉片早衰、防御反應(yīng)及非生物脅迫途徑中扮演著重要作用,其生化作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

而外因則主要包括極端低溫、黑暗、干旱、營養(yǎng)缺乏、機(jī)械損傷、臭氧和病原菌侵染逡逑等各種脅迫的刺激［３，４５４吹因此，葉片衰老的過程并不是受某個(gè)單一因素調(diào)控的，而是存逡逑在一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［３］（圖１．２）。逡逑

ｐｒｏｔｅｉｎｓ，邋ＣｍＤ４）結(jié)構(gòu)域［２１５］。該結(jié)構(gòu)域的主要組成在植物中高度保守，包括典型的核苷酸逡逑結(jié)合激酶ｌａ邋（Ｐ－ｌｏｏｐ），激酶２邋（ＷａｌｋｅｒＢ）和激酶３ａ邋（ＲＮＢＳ－Ｂ）和一些功能未知的保守逡逑基序如ＲＮＢＳ－Ａ，ＲＮＢＳ－Ｃ，ＧＬＰＬ，邋ＲＮＢＳ－Ｄ，ＭＨＤ［２１４】（圖１．３）。盡管這些基序的具體逡逑生化功能不是很明確，但是結(jié)構(gòu)域替換實(shí)驗(yàn)證明它們?cè)谛惺梗危拢蹋遥业鞍坠δ苤卸际遣诲义峡苫蛉钡模郏玻保担�。逡逑１．３．３羧基端ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域及其功能逡逑ＮＢ＾ＬＲＲ邋蛋白邋Ｃ邋端的邋ＬＲＲ邋結(jié)＿或一Ｍ丨堤由邋ＬｘｘＬｘｘＬｘｘＬｘＬｘｘ（Ｎ／Ｃ／Ｔ）ｘ（Ｘ）ＬｘｘＩＰｘｘ邋（ｘ邋表示任逡逑意氨基酸殘基）重復(fù)組成它是因亮氨酸在結(jié)構(gòu)中呈規(guī)律的重復(fù)而命名的。但每個(gè)ＬＲＲ逡逑的一級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)數(shù)上有很大的變化。研究表明，ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域能識(shí)別病原物無毒基因產(chǎn)逡逑物，弓Ｉ發(fā)抗性反應(yīng)的產(chǎn)生是抗病專化性的基礎(chǔ)［２１８］。例如，在Ｐ／ｔｏ／ｄｖｒ－Ｐ／ｔｏ的直接互逡逑作中，，Ｐ／ｔｏ表達(dá)產(chǎn)物與ｄｖｒ－Ｐ／ｔｏ表達(dá)產(chǎn)物的特異性結(jié)合與ＬＲＲ區(qū)域有關(guān)１２１９］。逡逑與下游信號(hào)分邐｜參與對(duì)上游ＡＶＲ逡逑子互作的平臺(tái)邐￥邐蛋白特異性識(shí)別逡逑\l＼弩逡逑ｙ邋＜ｓ＞邋0邋＼邋0逡逑通過ＡＴＰ水解酶活性調(diào)逡逑控分子構(gòu)象以釋放信號(hào)逡逑圖１．３ＮＢ－ＬＲＲ蛋白分子結(jié)構(gòu)圖［２２（）］逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ．３邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ＮＢ－ＬＲＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.11

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