【摘要】：葉片衰老是一個復雜的生物學過程,通常發(fā)生在植物發(fā)育的最后階段,由環(huán)境信號和多基因網(wǎng)絡參與調控。類病變突變體能自發(fā)形成類似于過敏反應的壞死斑,且大多數(shù)突變體能表現(xiàn)出對一種或多種病原菌的抗性,是一類研究植物防御反應機制的理想材料。盡管目前對植物葉片衰老和防御反應的分子機理有了一定的研究,但其分子調控網(wǎng)絡仍有待進一步豐富和解讀,從而為開展水稻分子設計育種,培育抗衰老高產新品種打下基礎。本研究通過EMS誘變粳稻品種云稻32(Y32)種子獲得兩個穩(wěn)定遺傳的類病變早衰突變體,分別命名為:lmes3(lesion mimic and early senescence 3)和 lmes4(lesion mimic and early senescence 4)。經(jīng)表型鑒定、基因定位與克隆、抗性鑒定及功能分析等相關研究,主要結果如下:1、lmes3突變體苗期地上部表現(xiàn)正常,但根系發(fā)育受阻;分蘗早期葉片就出現(xiàn)鐵銹斑表型,隨著植株的生長,斑點數(shù)目增加;進入孕穗期,葉尖開始枯黃,出現(xiàn)早衰表型;抽穗期枯黃從葉尖開始沿著葉邊一直延續(xù)到葉的底部;成熟期斑點連片存在,衰老加速,葉片全部枯黃,整個植株呈黃褐色直至提前枯死。在苗期和分蘗期對植株進行低溫處理時,能誘導lmes3突變體表現(xiàn)出早衰現(xiàn)象。lmes4突變體苗期地上部也表現(xiàn)正常,在分蘗早期葉片出現(xiàn)類似于過敏反應(hypersensitive response,HR)的類病斑,同時整片葉片葉脈間的葉肉部分出現(xiàn)失綠黃化癥狀,而葉脈仍然保持綠色;到抽穗期時,突變體下部葉片葉尖枯黃加劇,上部功能葉片葉尖開始枯黃并伴有水漬狀斑點,整片葉片葉脈間的失綠黃化癥加重;成熟期葉尖完全枯黃,葉脈間黃化癥連片出現(xiàn),并從葉尖一直延續(xù)到葉中部,直到整片葉片三分之一以上完全枯死;成熟后20d,突變體葉尖完全枯死,但整片葉片還有部分保持綠色,葉片表現(xiàn)為過早衰老。與野生型相比,lmes3突變體的抽穗期晚3d,lmes4突變體的抽穗期晚2d,lmes3和lmes4突變體的株高、結實率及千粒重均顯著性降低,而穗長、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)差異不明顯。2、遺傳分析表明,lmes3和lmes4突變表型均受單隱性核基因控制。利用圖位克隆法,最終將LMES3基因定位在第5染色體P27和P33之間約55kb的物理區(qū)間內;將LMES4基因定位在第1染色體M25和M48之間約48kb的物理區(qū)間內。通過RGAP(Rice Genome Annotation Project)網(wǎng)站上的注釋查詢,發(fā)現(xiàn)LMES3基因定位的區(qū)間包含8個開放閱讀框(open reading frame,ORF),測序發(fā)現(xiàn)第2開放閱讀框上發(fā)生一個G到A的單堿基突變,造成了編碼的氨基酸由谷氨酸(Glu)替換成了賴氨酸(Lys),經(jīng)轉基因互補和過表達實驗證實其就是LMES3的候選基因。LMES4基因定位的區(qū)間包含7個開放閱讀框,測序發(fā)現(xiàn)第6開放閱讀框上發(fā)生一個G到A的單堿基突變,造成編碼氨基酸由色氨酸(Try)替換成了終止子,導致翻譯提前終止,最終造成蛋白質功能缺失。3、LMES3和LMES4為兩個未報道控制葉片早衰的新基因。組織特異表達分析表明LMES3基因在各個組織器官均有表達,其中在莖中表達量最高。亞細胞定位分析表明,LEMS3蛋白最終定位于細胞膜上。4、葉綠素含量的下降是葉片衰老的重要生理指標。相關測定結果顯示,lmes3和lmes4突變體葉片中葉綠素的含量較野生型均顯著下降,這表明兩個突變體在生理水平上均已經(jīng)開始早衰。衰老誘導的SGR(STAY GREEN)基因在調節(jié)葉綠素降解代謝的過程中發(fā)揮著重要的作用,而 qRT-PCR(quantitative real-time,PCR)也證明 SCG 在lmes3和lmes4突變體的葉片中的表達量均顯著上調。此外,lmes3和lmes4突變體的離體葉片在黑暗誘導下均比野生型衰老更為迅速和劇烈,這表明LMES3和LMES4基因的突變加快了葉片衰老。5、葉肉細胞的超微結構顯示,lmes3和lmes4突變體的葉綠體中類囊體排列比較紊亂,片層排列不規(guī)則,嗜鋨顆粒的數(shù)量增多,體積增大,顏色加深,且lmes4中葉綠體數(shù)目有所減少。這些結果表明LMES3和LMES4基因突變影響了葉綠體的發(fā)育,從而導致葉綠素含量顯著下降,葉片提前衰老。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)lmes4葉片單位葉面積內氣孔和周邊排列的硅質化爪狀突起的數(shù)目減少,表明其水分蒸騰作用下降,推測一些隨水份吸收和流動的礦質鹽類(無機鹽)運輸減弱,進而導致葉片正常生理活動受阻,造成葉片早衰。6、組織化學染色表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)——超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)在lmes3和lmes4突變體葉片中積累,葉片丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增加,這些結論充分表明lmes3和lmes4突變體葉片已經(jīng)發(fā)生早衰。為了探索lmes3和lmes4突變體中ROS的代謝過程,檢測了野生型和突變體中抗氧化酶過氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)的酶學活性,其中POD和SOD活性在lmes3和lmes4突變體的葉片中顯著升高,而CAT活性則顯著降低。POD和SOD活性的升高表明lmes3和lmes4突變體可能在積極地響應H2O2和O2-的積累,而lmes3和lmes4突變體葉片中CAT活性的降低可能不足以清除這些額外的H2O2,致使H2O2大量積累。積累的ROS在lmes3和lmes4突變體的葉片早衰和防御反應過程中發(fā)揮著重要的作用。7、qRT-PCR分析表明,在lmes3和lmes4突變體葉片中,衰老相關的標志基因Osl2和Osl85,相關的轉錄因子OsWRKY23和OsNAC2表達均上調,光合系統(tǒng)相關基因rbcS、lhcA、lhcB表達均下調。這些結果在分子水平上證實了 lmes3和lmes4突變體的葉片發(fā)生了早衰。8、接種白葉枯病菌浙173(Z173)后,野生型Y32植株表現(xiàn)出典型的白葉枯病發(fā)病癥狀,而突變體植株卻顯著提高了對白葉枯病的抗性。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)防御反應相關基因PR1a、PBZ1和OsWRKY45的表達量在lmes3和lmes4突變體葉片中均顯著上調。這些結果表明,LMES3和LMES4基因突變可激活植株防御反應,進而增強抗白葉枯病的能力。上述結果表明LMES3和LMES4基因突變可導致葉片早衰和防御反應的產生,ROS(02-和H2O2)可能參與了這兩個生物學過程。其中,水稻LMES3的編碼蛋白是一個多功能蛋白,在葉片早衰、防御反應及非生物脅迫途徑中扮演著重要作用,其生化作用機制仍有待進一步研究。
【圖文】：

而外因則主要包括極端低溫、黑暗、干旱、營養(yǎng)缺乏、機械損傷、臭氧和病原菌侵染逡逑等各種脅迫的刺激［３，４５４吹因此，葉片衰老的過程并不是受某個單一因素調控的，而是存逡逑在一個非常復雜的調控網(wǎng)絡［３］（圖１．２）。逡逑

ｐｒｏｔｅｉｎｓ，邋ＣｍＤ４）結構域［２１５］。該結構域的主要組成在植物中高度保守，包括典型的核苷酸逡逑結合激酶ｌａ邋（Ｐ－ｌｏｏｐ），激酶２邋（ＷａｌｋｅｒＢ）和激酶３ａ邋（ＲＮＢＳ－Ｂ）和一些功能未知的保守逡逑基序如ＲＮＢＳ－Ａ，ＲＮＢＳ－Ｃ，ＧＬＰＬ，邋ＲＮＢＳ－Ｄ，ＭＨＤ［２１４】（圖１．３）。盡管這些基序的具體逡逑生化功能不是很明確，但是結構域替換實驗證明它們在行使ＮＢ－ＬＲＲ蛋白功能中都是不逡逑可或缺的［２１５］。逡逑１．３．３羧基端ＬＲＲ結構域及其功能逡逑ＮＢ＾ＬＲＲ邋蛋白邋Ｃ邋端的邋ＬＲＲ邋結＿或一Ｍ丨堤由邋ＬｘｘＬｘｘＬｘｘＬｘＬｘｘ（Ｎ／Ｃ／Ｔ）ｘ（Ｘ）ＬｘｘＩＰｘｘ邋（ｘ邋表示任逡逑意氨基酸殘基）重復組成它是因亮氨酸在結構中呈規(guī)律的重復而命名的。但每個ＬＲＲ逡逑的一級結構和重復數(shù)上有很大的變化。研究表明，ＬＲＲ結構域能識別病原物無毒基因產逡逑物，弓Ｉ發(fā)抗性反應的產生是抗病專化性的基礎［２１８］。例如，在Ｐ／ｔｏ／ｄｖｒ－Ｐ／ｔｏ的直接互逡逑作中，，Ｐ／ｔｏ表達產物與ｄｖｒ－Ｐ／ｔｏ表達產物的特異性結合與ＬＲＲ區(qū)域有關１２１９］。逡逑與下游信號分邐｜參與對上游ＡＶＲ逡逑子互作的平臺邐￥邐蛋白特異性識別逡逑\l＼弩逡逑ｙ邋＜ｓ＞邋0邋＼邋0逡逑通過ＡＴＰ水解酶活性調逡逑控分子構象以釋放信號逡逑圖１．３ＮＢ－ＬＲＲ蛋白分子結構圖［２２（）］逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ．３邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ＮＢ－ＬＲＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S435.11

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