【摘要】：洛伐他汀是當(dāng)今世界治療高血脂癥控制膽固醇最有效果的藥物之一,目前洛伐他汀主要采用化學(xué)合成。紅曲霉有多種對(duì)人類有效的次生代謝產(chǎn)物,其中包括洛伐他汀。人們體內(nèi)的3-羥基-3-甲基-戊二酸單酞CoA還原酶對(duì)于調(diào)控膽固醇的合成起著關(guān)鍵性作用,洛伐他汀的生理功能是對(duì)此酶的活性有抑制作用,從而達(dá)到膽固醇量的減少,其中�；D(zhuǎn)移酶LovD在洛伐他汀的生物合成途徑中非常重要,本文將通過(guò)對(duì)LovD基因的研究轉(zhuǎn)化達(dá)到洛伐他汀產(chǎn)量的提高。本實(shí)驗(yàn)以通過(guò)紫外誘變篩選紅曲霉菌株M120-1為基礎(chǔ)材料,經(jīng)由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)LovD基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化的研究。提取紅曲霉菌株總RNA,通過(guò)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄技術(shù)克隆出LovD基因?qū)ζ錁?gòu)建載體,連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件,得到的轉(zhuǎn)化子通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)分析篩選高產(chǎn)洛伐他汀菌株。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法構(gòu)建優(yōu)質(zhì)且高效的紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),期待為紅曲霉洛伐他汀的基因功能方面的探究奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果:(1)提取紅曲霉菌株M120-1總RNA,合成cDNA序列,經(jīng)純化回收后,成功與表達(dá)載體連接,最終順利轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。(2)優(yōu)化后得到的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系為:將原生質(zhì)體稀釋為1×105個(gè)/mL;把紅曲霉接于PDA培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)13天;根癌農(nóng)桿菌的濃度培育至OD600值為0.6;乙酰丁香酮(AS)溶液稀釋為140μmol/L。(3)利用優(yōu)化后的體系對(duì)紅曲霉菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化,共得到了 1000左右的轉(zhuǎn)化子,隨機(jī)挑選了 12株進(jìn)行PCR鑒定有10株LovD基因順利導(dǎo)進(jìn)到紅曲霉基因組中。(4)將成功轉(zhuǎn)化的菌株培養(yǎng)后通過(guò)HPLC對(duì)洛伐他汀分析,其中MD-5洛伐他汀產(chǎn)量高達(dá)0.55 mg/mLL比原始菌株高出63%,經(jīng)傳代培養(yǎng)9代分析表明具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q933

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本文編號(hào)：2602814