【摘要】：苦參為清熱燥濕的傳統(tǒng)中藥材,其主要化學活性成分:苦參堿、氧化苦參堿和黃酮類已呈現(xiàn)較好的臨床應(yīng)用前景,現(xiàn)今廣泛用于臨床治療慢性病毒性肝炎、女性陰道炎癥及人類各種癌癥。已知核糖體蛋白和熱應(yīng)激蛋白分別對維持植物的正常生命活動和減輕逆境脅迫引起的傷害有著非常重要的作用,因此本實驗對苦參核糖體蛋白S13(Ribosomal Protein S13,RPS13)和熱應(yīng)激蛋白(Heat Shock Protein,HSP)HSP17.8進行了克隆、體外表達并分析了這些蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點及生物學功能。目的:克隆常用中藥苦參中重要的功能基因:RPS13基因和HSP17.8基因,并在體外誘導其表達相應(yīng)的目的蛋白,系統(tǒng)地分析目的蛋白的物理化學性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)等生物學信息,初步探討苦參這兩類蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。方法:基于苦參轉(zhuǎn)錄組分析獲得的Unigene數(shù)據(jù),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性擴增引物,提取苦參總RNA并用酶標儀和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度和完整性。利用RT-PCR法對RPS13基因和HSP17.8基因的開放閱讀框進行擴增,將擴增片段與pMD19-T Vector進行連接,用雙酶切法(Nde I/Xho I)、菌液PCR法及測序法對重組質(zhì)粒進行驗證。將雙酶切后回收的擴增片段與pET22b(+)Vector進行連接,同樣用雙酶切法(Nde I/Xho I)、菌液PCR法及測序法對重組質(zhì)粒進行鑒定。系統(tǒng)地對RPS13和HSP17.8進行生物學信息分析,目的蛋白用不同濃度的IPTG誘導劑在不同溫度、時間下誘導,最后用western blot分析苦參RPS13和HSP17.8的表達水平。結(jié)果:(1)總RNA提取結(jié)果:OD_(260nm)/OD_(280nm)比值為1.92、1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示RNA的28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA三個條帶均清晰可見。(2)RT-PCR實驗結(jié)果為:三個RPS13 PCR結(jié)果顯示在分子量為500 bp左右出現(xiàn)明亮條帶(理論分子量為456 bp);同樣地,HSP17.8 PCR結(jié)果顯示在分子量為500 bp左右出現(xiàn)明亮條帶(理論分子量為501 bp)。(3)雙酶切(Nde I/Xho I)、菌液PCR及測序結(jié)果:三個RPS13雙酶切結(jié)果和菌液PCR結(jié)果顯示在分子量為500 bp左右處均出現(xiàn)清楚的目的條帶,測序結(jié)果用DNAssist軟件比對發(fā)現(xiàn)與原來轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)里的序列一致;同樣地HSP17.8的雙酶切結(jié)果和菌液PCR結(jié)果也顯示在分子量為500 bp左右處均出現(xiàn)清楚的目的條帶,測序結(jié)果用DNAssist軟件比對發(fā)現(xiàn)也與原來轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)里的序列一致。(4)重組表達載體構(gòu)建后,雙酶切(Nde I/Xho I)、菌液PCR及測序結(jié)果正確。(5)生物信息學分析結(jié)果顯示:三個RPS13均屬于不穩(wěn)定蛋白,理論分子量約為17.2 KD,苦參與油棕樹的RPS13親緣關(guān)系最近,三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明苦參三個RPS13蛋白的N末端有4個α螺旋,C末端有3個α螺旋,這兩簇α螺旋通過長的無規(guī)卷曲連接。HSP17.8屬于穩(wěn)定蛋白,理論分子量約為17.8 KD,苦參與羽扇豆的HSP17.8的親緣關(guān)系最近,三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明苦參HSP17.8的4個α螺旋和5個β折疊形成了β1-α1-β2-α2-β3-α3-β4-α4-β5的折疊方式,5個β折疊相同方向,被α螺旋包裹在內(nèi)部,構(gòu)成了蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的內(nèi)部框架。(6)Western blot技術(shù)檢測苦參RPS13和HSP17.8的表達水平,結(jié)果顯示:16℃、0.5 mmol/L IPTG,24 h為RPS13-1的最佳表達條件;25℃、1 mmol/L IPTG,8 h為RPS13-2的最佳表達條件;25℃、0.1 mmol/L IPTG,8 h為RPS13-3的最佳表達條件;25℃、0.5 mmol/L IPTG,8 h為HSP17.8的最佳表達條件。結(jié)論:本研究首次從苦參中成功克隆RPS13s和HSP17.8基因開放閱讀框,并在體外得到了表達。分析了RPS13s和HSP17.8的理化性質(zhì)、進化關(guān)系、二級和三級結(jié)構(gòu)特點,為進一步研究該蛋白的結(jié)構(gòu)、功能奠定了實驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

：總 RNA 瓊脂糖凝膠電Fig 1. Total RNA isolatio增結(jié)果板，表 1 中的序列為堿基，以便更好的和克R 擴增，PCR 反應(yīng)體結(jié)果如圖 2 所示，三了預(yù)期大小的 RPS13

圖 1：總 RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1. Total RNA isolation.2 三個 RPS13 基因擴增結(jié)果以合成的苦參 cDNA 為模板，，表 1 中的序列為引物，用 rTaq 為 DNA 聚個RPS13基因末端帶上A堿基，以便更好的和克隆載體pMD19T-Vector 連 RPS13 均進行兩步法 PCR 擴增，PCR 反應(yīng)體系與溫度均一致，PCR 產(chǎn)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖 2 所示，三個 RPS13 均在分子量為 5出現(xiàn)明亮條帶，表明得到了預(yù)期大小的 RPS13 目的條帶。
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S567.53

【參考文獻】

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本文編號：2602566