【摘要】：苦參為清熱燥濕的傳統(tǒng)中藥材,其主要化學(xué)活性成分:苦參堿、氧化苦參堿和黃酮類已呈現(xiàn)較好的臨床應(yīng)用前景,現(xiàn)今廣泛用于臨床治療慢性病毒性肝炎、女性陰道炎癥及人類各種癌癥。已知核糖體蛋白和熱應(yīng)激蛋白分別對(duì)維持植物的正常生命活動(dòng)和減輕逆境脅迫引起的傷害有著非常重要的作用,因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦參核糖體蛋白S13(Ribosomal Protein S13,RPS13)和熱應(yīng)激蛋白(Heat Shock Protein,HSP)HSP17.8進(jìn)行了克隆、體外表達(dá)并分析了這些蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及生物學(xué)功能。目的:克隆常用中藥苦參中重要的功能基因:RPS13基因和HSP17.8基因,并在體外誘導(dǎo)其表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白,系統(tǒng)地分析目的蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等生物學(xué)信息,初步探討苦參這兩類蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。方法:基于苦參轉(zhuǎn)錄組分析獲得的Unigene數(shù)據(jù),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物,提取苦參總RNA并用酶標(biāo)儀和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的純度和完整性。利用RT-PCR法對(duì)RPS13基因和HSP17.8基因的開放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增片段與pMD19-T Vector進(jìn)行連接,用雙酶切法(Nde I/Xho I)、菌液PCR法及測(cè)序法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。將雙酶切后回收的擴(kuò)增片段與pET22b(+)Vector進(jìn)行連接,同樣用雙酶切法(Nde I/Xho I)、菌液PCR法及測(cè)序法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。系統(tǒng)地對(duì)RPS13和HSP17.8進(jìn)行生物學(xué)信息分析,目的蛋白用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)劑在不同溫度、時(shí)間下誘導(dǎo),最后用western blot分析苦參RPS13和HSP17.8的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)總RNA提取結(jié)果:OD_(260nm)/OD_(280nm)比值為1.92、1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示RNA的28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA三個(gè)條帶均清晰可見。(2)RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:三個(gè)RPS13 PCR結(jié)果顯示在分子量為500 bp左右出現(xiàn)明亮條帶(理論分子量為456 bp);同樣地,HSP17.8 PCR結(jié)果顯示在分子量為500 bp左右出現(xiàn)明亮條帶(理論分子量為501 bp)。(3)雙酶切(Nde I/Xho I)、菌液PCR及測(cè)序結(jié)果:三個(gè)RPS13雙酶切結(jié)果和菌液PCR結(jié)果顯示在分子量為500 bp左右處均出現(xiàn)清楚的目的條帶,測(cè)序結(jié)果用DNAssist軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)與原來轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)里的序列一致;同樣地HSP17.8的雙酶切結(jié)果和菌液PCR結(jié)果也顯示在分子量為500 bp左右處均出現(xiàn)清楚的目的條帶,測(cè)序結(jié)果用DNAssist軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)也與原來轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)里的序列一致。(4)重組表達(dá)載體構(gòu)建后,雙酶切(Nde I/Xho I)、菌液PCR及測(cè)序結(jié)果正確。(5)生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:三個(gè)RPS13均屬于不穩(wěn)定蛋白,理論分子量約為17.2 KD,苦參與油棕樹的RPS13親緣關(guān)系最近,三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明苦參三個(gè)RPS13蛋白的N末端有4個(gè)α螺旋,C末端有3個(gè)α螺旋,這兩簇α螺旋通過長(zhǎng)的無規(guī)卷曲連接。HSP17.8屬于穩(wěn)定蛋白,理論分子量約為17.8 KD,苦參與羽扇豆的HSP17.8的親緣關(guān)系最近,三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明苦參HSP17.8的4個(gè)α螺旋和5個(gè)β折疊形成了β1-α1-β2-α2-β3-α3-β4-α4-β5的折疊方式,5個(gè)β折疊相同方向,被α螺旋包裹在內(nèi)部,構(gòu)成了蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的內(nèi)部框架。(6)Western blot技術(shù)檢測(cè)苦參RPS13和HSP17.8的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:16℃、0.5 mmol/L IPTG,24 h為RPS13-1的最佳表達(dá)條件;25℃、1 mmol/L IPTG,8 h為RPS13-2的最佳表達(dá)條件;25℃、0.1 mmol/L IPTG,8 h為RPS13-3的最佳表達(dá)條件;25℃、0.5 mmol/L IPTG,8 h為HSP17.8的最佳表達(dá)條件。結(jié)論:本研究首次從苦參中成功克隆RPS13s和HSP17.8基因開放閱讀框,并在體外得到了表達(dá)。分析了RPS13s和HSP17.8的理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn),為進(jìn)一步研究該蛋白的結(jié)構(gòu)、功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

：總 RNA 瓊脂糖凝膠電Fig 1. Total RNA isolatio增結(jié)果板，表 1 中的序列為堿基，以便更好的和克R 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體結(jié)果如圖 2 所示，三了預(yù)期大小的 RPS13

圖 1：總 RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1. Total RNA isolation.2 三個(gè) RPS13 基因擴(kuò)增結(jié)果以合成的苦參 cDNA 為模板，，表 1 中的序列為引物，用 rTaq 為 DNA 聚個(gè)RPS13基因末端帶上A堿基，以便更好的和克隆載體pMD19T-Vector 連 RPS13 均進(jìn)行兩步法 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系與溫度均一致，PCR 產(chǎn)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖 2 所示，三個(gè) RPS13 均在分子量為 5出現(xiàn)明亮條帶，表明得到了預(yù)期大小的 RPS13 目的條帶。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.53

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2602566