【摘要】：小麥族(Triticeae)是禾本科(Poaceae)中一個(gè)重要的族,不僅包括小麥、大麥等重要麥類作物,還包含冰草、新麥草等優(yōu)良牧草,是一個(gè)糧飼兼用的族。小麥族蘊(yùn)藏著眾多優(yōu)異抗病基因,為普通小麥(Triticum aestivum L.)的抗病育種提供了極其豐富的抗病基因資源。其中,NBS基因家族是植物細(xì)胞內(nèi)普遍存在的主要抗性基因家族。本研究完成了五個(gè)物種RNA提取、測(cè)序、組裝,在轉(zhuǎn)錄組水平利用生物信息學(xué)方法挖掘NBS抗病基因家族序列。利用系統(tǒng)發(fā)生學(xué)以及進(jìn)化生物學(xué)的方法對(duì)物種間NBS基因家族進(jìn)化模式進(jìn)行系統(tǒng)分析。主要結(jié)果如下:1.五個(gè)小麥族物種轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝:對(duì)提莫菲維小麥(Triticum timopheevii)、茹科夫斯基小麥(Triticum zhukovskyi)、小傘山羊草(Aegilops umbellulata)、尾狀山羊草(Aegilops caudata)、黑麥(Secale Cereal)進(jìn)行二代、三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。采用“三+二”模式,利用二代無參組裝數(shù)據(jù)對(duì)三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行校正,得到高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本。提莫菲維小麥、茹科夫斯基小麥、小傘山羊草、尾狀山羊草、黑麥的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量分別為97653、58207、43573、49870、91170,N50的長(zhǎng)度分別為1434、1742、1856、1764、1972bp。2.同源性搜索及鑒定:對(duì)提莫菲維小麥、茹科夫斯基小麥、小傘山羊草、尾狀山羊草、黑麥五個(gè)物種蛋白序列進(jìn)行同源性搜索,閾值設(shè)為1e~(-50),同源性搜索的結(jié)果分別為50、96、40、68、160條,共414條。從植物抗病基因數(shù)據(jù)庫(kù)下載有胚植物代表性NBS蛋白序列,與候選NBS蛋白序列快速構(gòu)建序列進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)沒有單獨(dú)獨(dú)立出來的分支,表明同源檢索得到的414條蛋白序列可以作為NBS基因表達(dá)蛋白的同源序列進(jìn)行后續(xù)分析。3.NBS基因家族分類:對(duì)鑒定的候選蛋白序列進(jìn)行分類,發(fā)現(xiàn)五個(gè)物種中只存在CC-NBS-LRR(CNL)類抗病基因,與先前研究者們單子葉植物中只存在CNL類基因的結(jié)論一致。根據(jù)C末端LRR結(jié)構(gòu)域的有無,可分為NBS-LRR和NBS兩類。其中,NBS-LRR類蛋白序列分別為:33、59、27、38、111條,NBS類蛋白序列分別為17、37、13、30、49條。4.序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析:將鑒定的NBS蛋白序列與水稻中NBS蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì),比對(duì)結(jié)果中查找到五個(gè)物種NBS結(jié)構(gòu)存在公認(rèn)的P-loop(GGLGKTT)、Kinase-2(LLVLDDVW)、Kinase-3(GSRVLLTTR)、GLPL區(qū)(GGLPLA)四個(gè)保守基序,表明五個(gè)物種NBS蛋白序列相對(duì)保守。5.系統(tǒng)進(jìn)化分析:利用最大似然法構(gòu)建地錢為外群的系統(tǒng)進(jìn)化樹,這些序列分為明顯的兩支,表明NBS基因家族是由兩個(gè)分支進(jìn)化而來。它們可進(jìn)一步劃分為三組,由于五個(gè)物種不同類型NBS蛋白序列在三組中均有分布,且存在于不同的進(jìn)化枝中,不存在單獨(dú)的分枝,說明五個(gè)物種的進(jìn)化模式不存在單獨(dú)的特點(diǎn),而是有同樣的進(jìn)化模式。6.進(jìn)化壓力分析:計(jì)算三組同源基因?qū)Φ耐x替換率、非同義替換率以及它們之間的比率ω(=Ka/Ks)發(fā)現(xiàn),旁系同源基因的同義替換率Ks值普遍高于直系同源基因,表明五個(gè)物種中大多數(shù)基因復(fù)制事件的時(shí)間要早于物種分離時(shí)間。除此之外,直系同源基因的Ka/Ks值普遍高于旁系同源基因,表明在進(jìn)化過程中,直系同源基因受到的功能限制少,進(jìn)化的進(jìn)程更快。7.保守基序結(jié)構(gòu)分析:在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組均選擇質(zhì)量最高的15條CNL蛋白序列進(jìn)行保守基序分析,結(jié)果表明,不同組之間保守基序的類別是不同的,同一組的不同序列間,基序模型也并不完全相同,基序類型、數(shù)目、排列順序間均存在差異,據(jù)此推斷五個(gè)物種是通過基序的頻繁獲得與丟失的方式進(jìn)化的。此外,五個(gè)物種CNL蛋白序列的20類保守基序,長(zhǎng)度變化較大,在15~50個(gè)氨基酸之間,這說明了NBS基因家族成員之間保守性相對(duì)較高。
【圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文1 引言1.1 小麥族概述小麥族隸屬于禾本科的早熟禾亞科（Pooideae）（圖 1）（Kellogg, 2001），有明顯的穗部形態(tài)，花序呈穗狀、頂生，，穗的側(cè)面帶有兩個(gè)穎片的排列密集的小穗，小穗單生或 2～11 枚簇生于穗軸同節(jié)，小穗軸常脫節(jié)于穎之上，與早熟禾亞科中的其它族形成明顯區(qū)別（劉玉萍等, 2013）。在生物學(xué)上，這個(gè)族囊括了生物學(xué)機(jī)制和遺傳學(xué)體系的所有類型：二倍體和多倍體；一年生和多年生；自花授粉和異化授粉，甚至無融合生殖。由于變異如此之大，小麥族常被用作植物遺傳學(xué)、育種學(xué)、分類學(xué)、遺傳多樣性和物種形成研究的材料（董玉琛和鄭殿升, 2000）。

圖 2 小麥族代表性屬間基因組關(guān)系示意圖Fig.2 Summary of relationships among genera of the Triticeae小麥族的祖先很可能都是二倍體（或古多倍體）、多年生、異花授粉。從最初的圓錐花序，逐步發(fā)展成為穗上的每個(gè)穗軸節(jié)片著生 3 個(gè)小穗，再到后來大多數(shù)物種一個(gè)穗軸節(jié)片著生一個(gè)小穗（Sakamoto et al., 1973）。Runemark 等（1968）認(rèn)為小麥族屬間進(jìn)化分為 5 步：（1）二倍體（古多倍體）的進(jìn)化，多年生的屬之間異花授粉；（2）頻繁
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S512.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2602487