【摘要】：草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一,而草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)引起的草魚出血病,是危害草魚養(yǎng)殖業(yè)的主要病毒性疾病。草魚呼腸孤病毒為雙鏈RNA病毒,含11個基因片段編碼11~12個蛋白,同時根據(jù)基因型分類為GCRV I型、II型和III型,其中II型是主要的流行病毒,致死率高。但是目前針對II型GCRV的疫苗種類很少,無法滿足生產(chǎn)實際的需要,嚴重制約著草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本論文以草魚呼腸孤病毒河南分離株GCRV-HN14為研究對象,生物信息學分析為II型草魚呼腸孤病毒,其中S11序列片段編碼的VP35蛋白含有鋅指結(jié)構(gòu)基序,該基序也存在于其他呼腸孤病毒外衣殼蛋白中,所以推測VP35是外衣殼蛋白;S7序列編碼的VP56蛋白類似腺病毒的纖維突起蛋白,稱為類纖突蛋白,推測其具有類似于纖突蛋白中和病毒的能力而表現(xiàn)較好的免疫原性�；诖�,本論文采用S11節(jié)段,構(gòu)建真核和原核表達載體,制備DNA疫苗和亞單位疫苗,針對S7節(jié)段制備亞單位疫苗,分別免疫草魚后檢測了一系列免疫保護指標進行疫苗效果評價。本文的主要內(nèi)容如下:1.DNA疫苗的制備與免疫效果評價以GCRV-HN14病毒基因組為模板,通過反轉(zhuǎn)錄、基因克隆,獲得S11片段。將S11序列ORF插入pcDNA3.1(+)真核表達載體,構(gòu)建重組表達載體pcDNA3.1-s11并測序驗證,重組質(zhì)粒作為DNA疫苗。通過Western blot驗證,pcDNA3.1-s11在草魚腎細胞中成功表達重組蛋白VP35。之后,以10μg pcDNA3.1-s11肌肉注射草魚,設PBS為對照組,pcDNA3.1(+)為空載體組,于免疫后1、7、14、21、28、35、42和49 d收集樣品,采用一系列指標評價免疫保護效果。結(jié)果如下:(1)質(zhì)粒在魚體內(nèi)分布表達檢測:通過PCR檢測,在血液、肝臟、脾臟、腎臟和肌肉中均有pcDNA3.1-s11分布;通過Western blot檢測質(zhì)粒表達,僅在肌肉中有重組蛋白VP35表達。(2)外周血細胞數(shù)量變化以及白細胞分類計數(shù):pcDNA3.1-s11疫苗免疫草魚后,各組間紅細胞數(shù)量沒有顯著性差異(p0.05);與對照組相比,免疫組白細胞數(shù)量在免疫后1、7和14 d顯著增加(p0.05或p0.01);免疫草魚體內(nèi)中性粒細胞和淋巴細胞的比例明顯增高,在7 d單核細胞百分比達到峰值[(24.13±2.38)%;p0.01],在14 d淋巴細胞比例達到峰值[(93.30±4.71)%;p0.05]。(3)血清抗體效價檢測:在免疫后7 d,免疫草魚體內(nèi)產(chǎn)生了抗VP35蛋白的抗體,免疫后28 d抗體效價最高(OD_(450nm)為0.79±0.06;p0.01)。(4)免疫相關(guān)基因:IFN1、TLR22、MHC I和IgM在頭腎和脾臟中的相對表達量變化顯示,四種免疫基因的表達量在免疫后均有不同程度的上調(diào)。與對照組相比,頭腎中IFN1在免疫后7 d開始上調(diào),第14 d呈現(xiàn)最高,上調(diào)11.68倍(p0.01);脾臟中IFN1在14 d上調(diào),第21 d達到峰值,上調(diào)17倍左右(p0.01)。頭腎與脾臟的TLR22在1 d顯著上調(diào),在第14 d達到最高,分別約上調(diào)6倍和120倍(p0.05或p0.01)。頭腎與脾臟的MHC I的表達變化與TLR22相似,在1 d開始上調(diào),第21 d達到峰值(p0.05或p0.01)。頭腎與脾臟的IgM在7 d開始上調(diào),分別在35 d和28 d上調(diào)11.59倍和17.84倍,達到峰值(p0.01)。(5)免疫保護率:在免疫后21 d攻毒,pcDNA3.1(+)組和空白對照組的死亡率在90%~95%,pcDNA3.1-s11免疫組死亡率為26.7~29.6%,DNA疫苗的相對保護率約為70%。2.VP35亞單位疫苗的制備與免疫效果評價將S11片段克隆到原核表達載體pET-32a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-VP35,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3。通過SDS-PAGE對重組蛋白(rVP35)的可溶性分析,rVP35主要以包涵體形式存在。同時優(yōu)化重組蛋白表達條件后,選擇1 mM IPTG誘導6 h,進行誘導表達。Ni柱純化及復性獲得重組蛋白,以每尾腹腔注射30μg rVP35免疫草魚,于免疫后1、3、5、7、14、21、28和35 d收集樣品,進行一系列指標評價免疫保護效果。結(jié)果如下:(1)外周血細胞數(shù)量以及白細胞分類比例變化:rVP35免疫后,白細胞數(shù)量顯著高于對照組,其中單核細胞、中性粒細胞和淋巴細胞百分比顯著升高。免疫草魚體內(nèi)紅細胞數(shù)目維持在(2.03±0.07)×10~9/mL,與對照組無差異(p0.05)。白細胞數(shù)量在第3 d開始升高,第5 d達到峰值[(7.92±0.72)×10~7/mL;p0.05];中性粒細胞和單核細胞百分比在免疫第3 d升高并達到峰值分別為(18.70±1.78)%和(12.22±1.28)%(p0.05);隨后淋巴細胞百分比在免疫第14 d顯著升高達到峰值[(92.37±3.11)%;p0.01]。(2)血清抗體效價檢測:在免疫第14 d草魚體內(nèi)產(chǎn)生了抗VP35蛋白的抗體,免疫后21 d抗體效價最高(OD_(450nm)為0.65±0.07;p0.01),在免疫第35 d仍有較高水平的抗體存在。(3)免疫相關(guān)基因:IFN1、TLR22、MHC I和IgM在頭腎和脾臟中的相對表達量變化顯示,與對照相比,IFN1在頭腎和脾臟的相對表達量在第5 d開始升高,分別在第14 d和7 d達到峰值,上調(diào)30~40倍(p0.01);TLR22的相對表達量在第3 d顯著上調(diào),在頭腎中上調(diào)4.04倍,在脾臟中上調(diào)10.55倍(p0.01);MHC I的相對表達量在第1 d開始升高,在第5 d達到峰值上調(diào)7~12倍(p0.01);在頭腎和脾臟中IgM的相對表達量分別在第14 d和5 d開始上調(diào),在頭腎中第21 d上調(diào)30倍左右(p0.01),在脾臟中第28 d上調(diào)20倍左右(p0.01)。(4)相對免疫保護率:在免疫第21 d攻毒,免疫組和對照組存活率約為66.7%和16.7%,rVP35蛋白亞單位疫苗的相對保護率為60%。3.VP56亞單位疫苗的制備與免疫效果評價將S7節(jié)段C端993 bp序列克隆到原核表達載體pET-32a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-VP56。選擇1mM IPTG誘導6 h,進行誘導表達重組蛋白(rVP56),可溶性分析顯示,rVP56以包涵體形式存在。Ni柱純化及復性獲得重組蛋白,以每尾魚30μg腹腔注射免疫草魚,于免疫后1、3、5、7、14、21、28和35 d收集樣品,進行免疫保護效果評價。結(jié)果如下:(1)草魚外周血細胞數(shù)量變化以及白細胞分類計數(shù):與對照組相比,免疫組紅細胞在第5 d顯著升高,第7 d達到峰值[(2.98±0.17)×10~9/mL;p0.05];白細胞數(shù)量在第5、7和14 d顯著高于對照組(p0.05或p0.01),在7 d達到峰值[(8.42±1.00)×10~7/mL,p0.05]。單核細胞、中性粒細胞百分比變化趨勢相似,均在第5 d達到峰值分別為(9.05±0.92)%和(25.93±2.60)%(p0.05或p0.01);隨后淋巴細胞大量增殖,在14 d淋巴細胞比例達到峰值[(85.81±2.73)%,p0.01]。(2)抗體效價檢測:免疫后草魚體內(nèi)產(chǎn)生了抗rVP56的抗體,在21 d最高,OD_(450nm)為0.34±0.01(p0.01)。(3)實時熒光定量PCR檢測免疫相關(guān)基因結(jié)果顯示,IFN1、TLR22和MHC I的相對表達量在免疫前期上調(diào)明顯,IFN1和MHC I基因的相對表達量在頭腎和脾臟組織中在第5 d上調(diào)到峰值,其中頭腎的IFN1和MHC I的相對表達量分別為19.71和38.18(p0.01),脾臟中的IFN1和MHC I的相對表達量分別為7.65(p0.01)和7.73(p0.05)。TLR22的相對表達量在頭腎中第5 d上調(diào)至峰值為3.25,在脾臟中第3 d上調(diào)至峰值為9.78(p0.01)。IgM的相對表達量在頭腎和脾臟中在第21 d上調(diào)至峰值分別為47.22(p0.01)和18.91(p0.05)。(4)相對免疫保護率:攻毒試驗顯示,rVP56免疫保護草魚后,存活率為73.3~76.7%,而對照組存活率僅為6.67~16.7%左右,相對保護率約為75%。本研究基于本地分離的草魚呼腸孤病毒,采用基因工程方法創(chuàng)制了三種基因工程疫苗。免疫草魚后,采用不同的免疫指標,分別對其免疫效果進行評價,發(fā)現(xiàn)三種不同疫苗均具有較好的免疫保護,相對免疫保護率在60%以上,最高為75%,表明這三種基因工程疫苗均具有工程化開發(fā)價值和應用前景。但疫苗創(chuàng)制方法、免疫劑量和免疫途徑仍需進一步優(yōu)化,以增強免疫效果和提高相對免疫保護率。
【圖文】：

圖 2 表示 DL1 PCR amte: Lane M2-1 S11 片段L2000；1、2mplication ofM: DL2000;擴增結(jié)果表示 S11PCS11 segmentLane 1 and 2Ct b2:

示 pFig; Lan dige C-s11后，一條圖pcDNA3.1(+)g.2-3 Digestione 1: pcDNAested by BamHCIK 細胞的1、空載體Western blo條特異條帶，，10002-3 雙酶切)；2 表示 pcDon identificatA3.1(+); LanemH I.的表達pcDNA3.1ot 檢測轉(zhuǎn)染在空載體M 1切驗證NA3.1-s11 雙tion of pcDNA2: pcDNA3.(+)通過脂質(zhì)染后細胞，重pcDNA3.1(2 3雙酶切產(chǎn)A3.1-s111-s11 dige質(zhì)體 Lip重組質(zhì)粒(+)和未
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S943

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本文編號：2600834