【摘要】：有絲分裂和減數(shù)分裂是生物體中非常重要的細胞分裂過程。有絲分裂在維持生物個體的正常生長和發(fā)育中起著重要作用;減數(shù)分裂保證有性生殖生物世代之間染色體數(shù)目的穩(wěn)定性,亦為有性生殖過程中創(chuàng)造變異提供了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。DNA雙鏈斷裂(DSB)作為一種DNA損傷現(xiàn)象,對有絲分裂和減數(shù)分裂都有著重要影響。MRE11是一個與細胞分裂相關(guān)的重要基因,已有研究表明該基因與DNA損傷修復有著重要關(guān)系。MRE11與RAD50和NBS1共同組成MRN復合體,參與DNA損傷修復,任一蛋白的缺陷都會嚴重影響DNA修復過程。目前有關(guān)OsMRE11基因?qū)λ居薪z分裂和減數(shù)分裂調(diào)控的研究較少,因此我們以O(shè)sMRE11為對象,通過對該基因在水稻中不同等位突變的表型分析及目標蛋白的功能研究,來探索MRE11蛋白在DSB修復途徑中的詳細作用,以期望初步解析其在有絲分裂及減數(shù)分裂這兩種細胞分裂方式中的功能差異。本研究中,我們通過T-DNA插入突變體鑒定及CRISPR/Cas9技術(shù),獲得水稻OsMRE11三個不同等位突變體,分別命名為Osmre11-1、Osmre11-2和Osmre11-3。通過對三者營養(yǎng)生長及生殖生長的詳細觀察和分析,我們發(fā)現(xiàn)不同Osmre11等位突變體均表現(xiàn)出明顯的配子發(fā)生缺陷,植株不育。細胞學分析顯示突變體花粉母細胞染色體行為異常,終變期及中期Ⅰ發(fā)生染色體黏連,后期Ⅰ產(chǎn)生大量染色體碎片,導致遺傳物質(zhì)不能在子代細胞均等分配,致使植株不育。以上減數(shù)分裂異常表型與已報道的OsMRE11RNAi株系中獲得的結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上,我們采用免疫染色方法檢測突變體中DSB形成和修復相關(guān)蛋白的定位情況,以及聯(lián)會復合體形成狀態(tài)。結(jié)果顯示,DSB指示信號γH2AX定位與野生型中結(jié)果相比沒有顯著差異,突變體前期Ⅰ早期染色體軸相關(guān)蛋白PAIR2和PAIR3可組裝成線,但是聯(lián)會復合體橫絲蛋白ZEP1的裝配及延伸無法正常進行。而DSB修復相關(guān)蛋白OsDMC1則無法定位于突變體減數(shù)分裂染色體上,同時DSB修復產(chǎn)物交叉的指示蛋白HEI10的定位亦受到明顯影響。上述結(jié)果表明OsMRE11對于水稻減數(shù)分裂同源重組及同源染色體聯(lián)會是必須的。通過對水稻Osmre11-1、Osmre11-2和Osmre11-3這三個不同等位突變體營養(yǎng)生長觀察發(fā)現(xiàn),Osmre11-1和Osmre11-2的營養(yǎng)生長受到了明顯抑制,幼苗和成株的高度約為野生型高度的50%;與之相異的是,Osmre11-3突變植株的營養(yǎng)生長基本正常,植株高度未受影響。比較分析Osmre11-1、1-2和Osmre11-3的突變位點,我們發(fā)現(xiàn)三個不同等位突變體中突變基因均編碼蛋白發(fā)生移碼并提前終止,而(Osmre11-2和OOsmre11-3兩者編碼的截斷蛋白僅相差29個氨基酸。結(jié)合表型與序列分析我們推測這29個氨基酸很可能是OsMRE11調(diào)控水稻有絲分裂的特異位點。綜上所述,本研究通過對水稻OsMRE11基因不同等位突變的表型研究及蛋白結(jié)構(gòu)分析,證明OsMRE11通過參與水稻性母細胞同源修復過程而調(diào)控減數(shù)分裂。這種調(diào)控作用依賴于OsMRE11蛋白整體功能,不存在位點差異;而OsMRE11在水稻有絲分裂過程中的重要作用很可能存在氨基酸位點差異性。有關(guān)OsMRE11對水稻兩種細胞分裂方式的差異調(diào)控,需要進一步研究及驗證。
【圖文】：

圖１．１有絲分裂的基本過程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｂａｓｉｃ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｍｉｔｏｓｉｓ．逡逑１．４減數(shù)分裂主要過程逡逑減數(shù)分裂和有絲分裂相比，有其特殊的地方，也有很多共同點。減數(shù)分裂同樣分為裂間期和分裂期兩部分，在整個過程中ＤＮＡ同樣復制一次，經(jīng)歷前中后末四個時期。是減數(shù)分裂過程中細胞會分裂兩次，而且減數(shù)第一次分裂的前期持續(xù)時間相對較長，發(fā)許多重要的生物學事件。逡逑１．４．１減數(shù)第一次分裂逡逑前期Ｉ：逡逑該時期是減數(shù)分裂中相當重要的時期，被分為細線期、偶線期、粗線期、雙線期和。逡逑

ＭＩＴＯＳＩＳ逡逑５．邋Ａｎａｐｈａｓｅ逡逑圖１．１有絲分裂的基本過程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｂａｓｉｃ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｍｉｔｏｓｉｓ．逡逑１．４減數(shù)分裂主要過程逡逑減數(shù)分裂和有絲分裂相比，有其特殊的地方，也有很多共同點。減數(shù)分裂同樣分為分逡逑裂間期和分裂期兩部分，在整個過程中ＤＮＡ同樣復制一次，經(jīng)歷前中后末四個時期。但逡逑是減數(shù)分裂過程中細胞會分裂兩次，而且減數(shù)第一次分裂的前期持續(xù)時間相對較長，發(fā)生逡逑許多重要的生物學事件。逡逑１．４．１減數(shù)第一次分裂逡逑前期Ｉ：逡逑該時期是減數(shù)分裂中相當重要的時期，被分為細線期、偶線期、粗線期、雙線期和終逡逑變期五個部分。逡逑細線期：染色質(zhì)開始濃縮成染色體的形態(tài)，呈細長的細線狀，ＤＮＡ復制已經(jīng)完成，，細逡逑胞核和核仁的體積開始增大。聯(lián)會復合體軸向元件開始組裝，程序性ＤＮＡ雙鏈斷裂開始逡逑發(fā)生，普遍認為細線期是減數(shù)分裂的起始。逡逑偶線期：染色體繼續(xù)濃縮
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S511

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