【摘要】：背景和目的:肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC),在我國的惡性腫瘤中發(fā)病率及死亡率均較高,2017年國家癌癥中心發(fā)布的報告顯示,肝細胞癌(簡稱肝癌)的發(fā)病率在男性位居第三,女性排名第六,而肝癌的死亡率更是高居第三。肝癌早期無典型的臨床癥狀,只有約30%~40%患者能夠接受根治性的治療,許多患者就診發(fā)現(xiàn)時已屬于晚期。而肝癌患者的根治性治療,無論肝移植還是手術切除,以及射頻消融等治療手段,都無法回避相對較高的復發(fā)率,其5年復發(fā)率高達70%。盡管精準肝切除及解剖性肝切除的理念及方法得到了廣泛的應用及推廣,但這些都并沒有帶來明顯改善肝癌的復發(fā)率及預后。隨著靶向及免疫治療在腫瘤治療中取得的突破性進展,尋找腫瘤治療的靶點成為了新的研究熱點。而在肝癌的研究中,缺乏有效的全身治療藥物已成為肝癌綜合治療的瓶頸,目前仍沒有找到明確的靶點。因此,探索新的靶向治療手段,以及加強對HCC發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制的研究變得十分有意義。McroRNAs(miRNAs)是由22-28一組的核苷酸小分子非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)組成,通過堿基互補的原理,它可特異性與靶基因結合抑制其表達。大量的研究結果指出,表達水平異常的miRNA與腫瘤疾病的發(fā)生及演變間存在密切的聯(lián)系。近年來,發(fā)現(xiàn)了大量在HCC中異常表達的miRNA,并證明參與了肝癌的相關調控。由于Dicer核酸酶在將前體miRNA加工成成熟的miRNA時,會產生兩個編輯體;成熟miR-XXX-5p,miRNA源自前體miRNA的5'末端,而miR-XXX-3p miRNA源自前體miRNA的3'末端。兩者的生物學功能可能并不相同,對于miRNA的精細化研究將更有利于我們了解其在腫瘤中的作用。已有報道m(xù)iR-221-3p與部分腫瘤相關,但在肝癌的發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮著調控作用尚未見有報道,因此,有必要去探索miR-221-3p對肝癌生物學行為的影響及其靶基因的預測。本項目研究中,首先通過實時定量qRT-PCR明確miR-221-3p在肝癌的組織和細胞株中的表達情況;然后用慢病毒轉染的方法上調及下調肝癌細胞系中miR-221-3p的表達,再應用完整的細胞功能學研究:包括細胞周期試驗、MTT試驗、克隆能力試驗、細胞凋亡試驗、細胞遷移及Transwell式樣等對miR-221-3p在肝細胞癌中的作用進行驗證;再選擇生物信息學相關技術對靶基因進行預測,經(jīng)實時定量熒光試驗、免疫組化及蛋白質電泳等方式明確研究miR-221-3p與下游靶基因的關系,最后用雙熒光素酶報告以驗證靶基因,從而明確miR-221-3p是否是通過抑制該靶基因的表達發(fā)揮在肝癌中的調控作用,發(fā)現(xiàn)miRNA參與肝癌調控的分子生物學機理,期望能為肝癌的臨床診療提供有意義的指標。方法:1.檢測miR-221-3p的在肝癌組織及肝癌細胞株中的表達收集新鮮標本:20對肝癌及其相應的癌旁組織,以及10例正常肝組織通過q RT-PCR檢測miR-221-3p的表達。然后用qRT-PCR檢測其在正常肝細胞及肝癌細胞系中的表達。2.明確miR-221-3p對肝癌細胞增殖及轉移的影響使用miR-221-3p慢病毒和對照組空白慢病毒miR-CON分別轉染肝癌細胞系SMMC-7721和BEL-7404兩種肝癌細胞系,選擇下游實驗:具體包括細胞周期試驗、MTT試驗、克隆能力試驗、細胞凋亡試驗、細胞遷移及Transwell式樣等方法,進一步闡述miR-221-3p在對肝癌細胞的增殖、轉移及侵襲能力的作用。3.預測及鑒定miR-221-3p的下游靶基因(1)通過預測軟件RNA hybrid及相關的預測網(wǎng)站micro RNA、Pictar和Target Scan篩選miR-221-3p的下游靶基因.(2)對20例HCC及其對應癌旁組織,以及10例正常肝組織應用免疫組化的方法檢測MGMT蛋白的表達情況。(3)利用慢病毒轉染的方法,將miR-221-3p轉染至SMMC-7721和BEL-7404細胞中,構建上調組和下調組,利用qRT-PCR和Western Blot檢測兩組及其對應NC組細胞中MGMTmRNA和MGMT蛋白的表達情況,明確miR-221-3p是否是MGMT上游的調控因子。(4)用雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)鑒定miR-221-3p與MGMT之間是否存在互補作用,從而證實在肝癌細胞中,MGMT是否為miR-221-3p的靶基因。結果:1.miR-221-3p的在肝癌組織及肝癌細胞株中的表達(1)miR-221-3p在肝癌、對應癌旁組織及正常肝組織中的表達通過qRT-PCR檢測miR-221-3p在肝癌、對應癌旁組織(20例),正常肝組織(10例)內的表達水平,研究結果指出:相比于正常組織,miR-221-3p基因能夠高表達于HCC組織內,比較結果具有顯著性差異(P0.01);但正常肝組織與癌旁組織內表達的miR-221-3p水平無顯著性差異(P0.05)。(2)miR-221-3p于肝癌細胞系和正常肝細胞內的表達通過qRT-PCR檢測,miR-221-3p在四種肝癌細胞系中的表達均高于正常細胞系HL-7702中的表達(P0.01),并且在SMMC-7721和BEL-7404肝癌細胞中表達較高。2.miR-221-3p對肝癌細胞增殖及轉移的影響(1)通過慢病毒載體將miR-221-3p轉染到SMMC-7721和BEL-7404細胞中,并通過q RT-PCR檢測其轉染效率。結果提示干擾效果顯著(P0.05)。,可用于后續(xù)實驗。(2)MTT實驗檢測轉染miR-221-3p后的SMMC-7721和BEL-7404細胞,檢測增殖能力,在酶標儀對波長490nm的光的吸收率變化倍數(shù)隨時間變化的對比。結果顯示:增殖實驗開始48小時后,與NC組相比,miR-221-3p down組的BEL-7402和SMMC-7721細胞的增殖受到了明顯抑制,miR-221-3p up組細胞的增殖能力明顯增強(P0.05)。說明miR-221-3p具有促進肝癌細胞增殖的功能。(3)FACS細胞凋亡實驗檢測,慢病毒感染SMMC-7721和BEL-7404細胞,培養(yǎng)5天后,miR-221-3p down組與NC組凋亡率對比。相比NC組,miR-221 down組凋亡數(shù)增多(SMMC-7721;5.48%±0.07%vs4.02%±0.265%,P0.05;BEL-7404;9.17%±0.189%vs 3.92%±0,0955,P0.05),而在miR-221-3p up組,凋亡細胞與NC組比較無明顯差異。結果提示下調miR-221-3p up能夠促進肝癌細胞的凋亡。(4)細胞周期實驗檢測,慢病毒感染SMMC-7721細胞,培養(yǎng)5天后,miR-221 up、miR-221 down組與NC組處在G1,S以及G2/M期的細胞占細胞總數(shù)的比例。相比NC組,miR-221-3p up、miR-221-3p down組處于S期的細胞無顯著變化,處于G1期的細胞減少(P0.05),處于G2/M期的細胞增多(P0.05)。在慢病毒感染BEL-7404細胞中,相比NC組,miR-221-3p up組處于S期的細胞增多(P0.05),處于G1期的細胞減少(P0.05),處于G2/M期的細胞無顯著變化;miR-221-3p down組處于S期的細胞無顯著變化,處于G1期的細胞減少(P0.05),處于G2/M期的細胞增多(P0.05).這說明可能不是通過影響細胞周期與肝癌細胞相互作用的。(5)本研究經(jīng)劃痕實驗結果顯示:miR-221-3p基因慢病毒感染SMMC-7721細胞,并劃痕于處理后0h、24h對細胞進行拍照,miR-221-3p down組的遷移能力(計算遷移率:為不同拍照觀察時間點遷移距離與“0hour”劃痕區(qū)域寬度值的比值)結果顯示:上調miR-221-3p后,SMMC-7721和BEL-7404細胞的遷移能力與NC組相比明顯增強(SMMC-7721:0.98±0.007 vs 0.9±0.009,P0.05;BEL-7404:0.65±0.02 vs 0.43±0.02;P0.05;),下調miR-221-3p后兩個肝癌細胞系的遷移能力NC組相比有明顯的減弱(SMMC-7721:0.58±0.007 vs 0.9±0.009;BEL-7404:0.24±0.02vs 0.43±0.02;P0.05;)。說明miR-221-3p在肝癌中促進了細胞的遷移。(6)Transwell侵襲實驗結果顯示:在SMMC-7721和BEL-7404細胞中,miR-221-3p up轉染組細胞的穿膜細胞數(shù)明顯多于NC組(SMMC-7721:71±1.68 vs 51±0.9;BEL-7404:184±9.63VS125±1.64,P0.05),同樣發(fā)現(xiàn)miR-221-3p down組細胞侵襲能力明顯低于NC組細胞(SMMC-7721:28±2.1vs51±0.9;BEL-7404:65±11.84vs125±1.64;P0.05)。結果提示:miR-221-3p可增強SMM-C7721細胞和BEL-7404細胞體外侵襲能力,下調miR-221-3p可抑制肝癌細胞的侵襲能力。(7)克隆形成實驗檢測,在慢病毒感染SMMC-7721和BEL-7404細胞組中:感染3天后種板,持續(xù)培養(yǎng)16天。相比NC組,miR-221-3p up組克隆數(shù)增多(SMMC-7721:116±3 vs 89±4;BEL-7404:160±5vs123±6;P0.05),miR-221-3p down組克隆數(shù)減少(SMMC-7721:49±6 vs 89±4;BEL-7404:85±4vs123±6;P0.05)。說明miR-221-3p促進了肝癌細胞的克隆能力,下調后肝癌細胞的克隆能力受到明顯抑制。3.預測及鑒定miR-221-3p的下游靶基因(1)生物信息學查詢,篩選可能是miR-221-3p調控的靶基因。根據(jù)miR-221-3p有促癌的作用,從初選基因中預測抑癌基因MGMT可能性最大通過,并在預測軟件RNA hybrid發(fā)現(xiàn)存在互補關系。(2)免疫組化提示MGMT蛋白的陽性表達反應物為棕黃色顆粒,主要定位于細胞漿。免疫組化結果顯示:在正常肝組織中有陽性表達,在肝癌組中低表達,兩者比較有顯著差異(P0.05)。(3)本研究用q-PCR對轉染后肝癌細胞SMMC-7721和BEL-7404中MGMTmRNA表達水平進行了檢測,發(fā)現(xiàn)miR-221-3p down組中的表達水平明顯高于NC組(P0.05);而miR-221-3p up組中表達水平明顯低于NC組結果有顯著性差異(P0.05)。(4)通過應用Western Blot對各組慢病毒轉染不同形態(tài)miR-221-3p的肝癌細胞系SMMC-7721和BEL-7404中MGMT基因翻譯蛋白的表達水平進行檢測,實驗發(fā)現(xiàn)與NC組對比,上調組的蛋白表達水平明顯受到抑制,而下調組的細胞中蛋白表達水平顯著上升,結果具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。(5)雙螢光素酶系統(tǒng)結果顯示:miR-221-3p與MGMT存在互補關系,能通過與MGMT中存在的3'UTR端,對其表達水平進行下調。結論:1.miR-221-3p能夠高表達于肝癌組織中,在肝癌細胞Hep G2、BEL-7404、Huh-7、SMMC-7721的表達明顯高于正常肝細胞中HL-7702。2.miR-221-3p是肝癌的一個促癌因子,下調后可抑制肝癌細胞的增殖、侵襲及轉移能力。3.MGMT是miR-221-3p的靶基因之一,miR-221-3p通過對靶基因MGMT的抑制,進而在肝癌中有助于介導癌細胞的增殖、轉移及侵襲等進程。
【圖文】：

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用軟件 SPSS19.0。經(jīng)非參數(shù)檢熒光定量測定結果，經(jīng)單因素方差對不同組別的 qRT-比較分析。驗結果 的提取估本研究所提取的總 RNA，對其純度及濃度進行檢測，1%）檢測 3 條清晰 rRNA 帶，，分別為 28s、18s 及 5s ，表明具有良好的質量（見圖 1）。

MicroRNA-221-3p 通過抑制靶基因 MGMT 促進肝癌細胞的增殖、轉移和侵襲 2.2 正常組織、肝癌及其癌旁組織內表達的 miR-221-3p 水平經(jīng) qRT-PCR 技術檢測 HCC 及其癌旁組織（20 例）、正常肝組內表達的 miR-221-3p 水平，研究結果指出：相比于正常組織，m基因能夠高表達于 HCC 組織內，比較結果具有顯著性差異（P<0正常肝組織與癌旁組織內表達的 miR-221-3p 水平無顯著性差異（見圖 1-2）。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

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9 榮震;許s

本文編號：2599675