【摘要】：桃小食心蟲是我國北方果樹生產中發(fā)生與危害最為廣泛的食心蟲類害蟲之一,由于具有分布廣、隱蔽性強、自然天敵少等特點難以防治。生產中主要通過化學農藥等措施來控制其為害,但在綜合防治措施中,由于性誘劑等引誘劑具有高效、專一性、不傷害益蟲、不污染環(huán)境等優(yōu)點,被廣泛應用。性信息素和寄主揮發(fā)物在害蟲的引誘過程中扮演著重要的角色,昆蟲利用其靈敏的嗅覺系統(tǒng)定位寄主食物和棲息場所、探求配偶、交配并產卵、躲避天敵等,而寄主揮發(fā)物與性信息素的結合使用能夠顯著增強引誘劑的效果。因此,本文對桃小食心蟲的嗅覺相關蛋白展開研究,并著重調查在雌雄之間的差異基因,從而為進一步開發(fā)高效的桃小食心蟲性誘劑、控制其種群數(shù)量奠定理論基礎。首先對桃小食心蟲雌雄觸角進行了二代轉錄組測序,通過同源比對等生物信息學方法等注釋并鑒定了嗅覺基因家族,然后著重研究了性信息素結合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)和普通氣味結合蛋白(general odorant binding proteins,GOBPs)的表達模式和功能。主要研究結果如下:1.桃小食心蟲觸角轉錄組測序及嗅覺基因的鑒定本研究使用Illumina HiSeq4000平臺對桃小食心蟲雌雄觸角進行了轉錄組測序,并通過生物信息學對嗅覺識別相關基因進行鑒定,共鑒定了 29個OBPs基因、13個CSPs和52個氣味受體基因(包括1個Orco)。OBPs的氨基酸多重序列比對結果表明其中19個具有OBPs的典型特征。另外,除了 5個OBPs(OBP1、OBP4、OBP9、OBP20、OBP22)外,其余OBPs均具有信號肽。進化樹分析結果表明,桃小食心蟲的GOBP3聚到了 GOBP1亞家族,而進一步同源矩陣分析發(fā)現(xiàn)GOBP3與其他昆蟲的GOBP1有較高的一致性,平均一致性為65.2%,表明GOBP3可能與GOBP1有著類似的生物功能;熒光定量結果顯示OBP7特異性地在雌雄觸角中表達,表明其可能在桃小識別性信息素、定位寄主植物和尋找合適產卵位點的過程中發(fā)揮重要作用;而其余OBPs(OBP7、OBP9、OBP12、OBP15、OBP19、GOBP1、GOBP3、PBP2)除了在觸角中高表達外,在其他組織中也有表達。本研究所鑒定的13個CSPs均有CSPs序列motif(C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4),即具有4個保守的半胱氨酸。另外,信號肽預測發(fā)現(xiàn)13個CSPs均具有完整的ORF,且均編碼信號肽序列。熒光定量結果表明在我們鑒定的3個CSPs(CSP1、CSP5、CSP12)中只有CSP5在觸角中特異性高表達,表明CSP5可能在桃小嗅覺識別過程中發(fā)揮關鍵作用;值得注意的是CSP1和CSP12均在雄蟲的腹中高表達,表明其可能在桃小的生長發(fā)育中發(fā)揮重要功能。對受體基因的跨膜結構域分析結果顯示52個ORs的跨膜結構為2-7個,信號肽預測發(fā)現(xiàn)其均為信號肽結構。熒光定量檢測了 14個ORs(OR3、OR4、OR8、OR17、OR21、OR24、OR30、OR31、OR33、OR34、OR41、OR46、OR48、OR49)的表達譜,結果表明ORs不僅在觸角中高表達,在其它組織中也有表達。其中9個ORs(OR4、OR17、OR21、OR24、OR34、OR46、OR48、OR49、GR8)在雌蟲觸角中的表達量顯著高于雄蟲觸角中,表明這幾個基因對桃小雌蛾定位寄主植物和尋找產卵位點的過程有著重要作用;4個ORs(OR8、OR30、OR31、OR33)在雄蟲觸角中顯著性高表達,表明其可能在識別性信息素過程中起關鍵作用。2.PBPs和GOBPs基因的分子克隆及功能分析首先通過RACE-PCR分子克隆得到PBPs和GOBPs基因,同時qRT-PCR轉錄水平和western蛋白水平檢測結果表明,PBPs和GOBPs基因在桃小雄蟲觸角中的表達量均顯著高于雌蟲。熒光競爭結合實驗結果表明,CsasPBP1和CsasPBP3主要識別Z-7-二十碳烯-11-酮,而CsasPBP2則主要負責識別Z-7-十九碳烯-11-酮,而除GOBP2外其余4個蛋白均與桃小的2種性信息素組分(Z-7-eicosene-11-one 和 Z-7-nonadecene-11-one)具有很強的結合能力,而只有 CsasPBP3 特異性地結合性信息素成分,CsasPBP1-2能夠與眾多的蘋果揮發(fā)物發(fā)生結合;GOBP1-2可以與寄主揮發(fā)物發(fā)生特異性結合。值得注意的是它們均與酯類化合物和烯類化合物有較強的結合能力,進一步分析發(fā)現(xiàn)這5個蛋白與6-7個碳原子的化合物結合力較弱。這表明碳鏈上的不飽和雙鍵存在以及碳鏈的長度與否顯著地影響了化合物分子與蛋白的結合能力。
【圖文】：

圖丨－１昆蟲的嗅覺反應及識別機制（Ｚｈｏｕ，邋２０１０）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｏｆ邋ｉｎｓｅｃｔ邋ｏｌｆａｃｔｉｏｎ邋（Ｚｈｏｕ，邋２０１０）逡逑１．４昆蟲嗅覺相關蛋白研究進展逡逑１．４．１氣味結合蛋白逡逑普通氣味結合蛋白（Ｇｅｎｅｒａｌ邋Ｏｄｏｒａｎｔ邋Ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＧＯＢＰｓ）和性信息素結合蛋

味結合蛋白（０ＢＰ９、ＯＢＰ１５、０ＢＰ２１，Ｇ０ＢＰ１和ＰＢＰ２）均在雄性觸角中顯著性表達，，而２個氣逡逑味結合蛋白（０ＢＰ７和ＯＢＰ１９）雌性觸角顯著表達（圖２－３Ａ）；邋ＣＳＰｓ、ＳＮＭＰｓ和ＧＲｓ的分析結逡逑果表明均只有一個基因在雌雄觸角中顯著性表達，分別為ＣＳＰ１２、ＳＮＭＰ２和ＧＲ８邋（圖２－３Ｂ－Ｃ）。逡逑在ＯＲｓ的分析結果中發(fā)現(xiàn)ＯＲ２（Ｏｒｃｏ）在ｍＲＮＡ水平有著極高的表達，并且在雌雄觸角中的表達逡逑量相當；另外，有３個ＯＲｓ邋（０Ｒ３１、ＯＲ３３和０Ｒ４１）在雄性觸角中顯著表達，然而有８個ＯＲｓ逡逑（０Ｒ４、ＯＲ１７、ＯＲ２４、ＯＲ３０、ＯＲ３４、ＯＲ４６、ＯＲ４８邋和邋ＯＲ４９）呈現(xiàn)出與以上相反的結果（圖逡逑２－３Ｄ）。而在我們所鑒定的所有嗅覺基因中，８個ＩＲｓ中均在雌雄觸角無顯著性差異（圖２－３Ｅ）；逡逑最后，我們發(fā)現(xiàn)在所有鑒定的候選基因中，ＧＲｓ的相對表達量最低（最大ＦＰＫＭ值＜４）。逡逑２．２．４氣味結合蛋白基因的鑒定及纟且織表達量分析逡逑在桃小食心蟲的觸角轉錄組中，共鑒別并注釋了邋２９個ＯＢＰｓ基因（包括２個ＧＯＢＰｓ和３個逡逑ＰＢＰｓ），其中除ＯＢＰ１和ＯＢＰ２３外，其余ＯＢＰｓ均具有完整的開放閱讀框ＯＲＦ，信號肽預測結果逡逑表明有５個ＯＢＰｓ邋（ＯＢＰ１、ＯＢＰ４、０ＢＰ９、ＯＢＰ２０和ＯＢＰ２２）不具有信號肽結構（表２－４）。根逡逑據(jù)ＯＢＰｓ蛋白的序列特征并與在其他淲翅目昆蟲己鑒定的ＯＢＰｓ氨基酸序列進行序列比對，我們逡逑發(fā)現(xiàn)共有１９個ＯＢＰｓ屬于典型ＯＢＰｓ家族（圖２－４）
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S433

【參考文獻】

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本文編號：2598661