【摘要】：桃小食心蟲是我國(guó)北方果樹生產(chǎn)中發(fā)生與危害最為廣泛的食心蟲類害蟲之一,由于具有分布廣、隱蔽性強(qiáng)、自然天敵少等特點(diǎn)難以防治。生產(chǎn)中主要通過(guò)化學(xué)農(nóng)藥等措施來(lái)控制其為害,但在綜合防治措施中,由于性誘劑等引誘劑具有高效、專一性、不傷害益蟲、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用。性信息素和寄主揮發(fā)物在害蟲的引誘過(guò)程中扮演著重要的角色,昆蟲利用其靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)定位寄主食物和棲息場(chǎng)所、探求配偶、交配并產(chǎn)卵、躲避天敵等,而寄主揮發(fā)物與性信息素的結(jié)合使用能夠顯著增強(qiáng)引誘劑的效果。因此,本文對(duì)桃小食心蟲的嗅覺(jué)相關(guān)蛋白展開研究,并著重調(diào)查在雌雄之間的差異基因,從而為進(jìn)一步開發(fā)高效的桃小食心蟲性誘劑、控制其種群數(shù)量奠定理論基礎(chǔ)。首先對(duì)桃小食心蟲雌雄觸角進(jìn)行了二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,通過(guò)同源比對(duì)等生物信息學(xué)方法等注釋并鑒定了嗅覺(jué)基因家族,然后著重研究了性信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)和普通氣味結(jié)合蛋白(general odorant binding proteins,GOBPs)的表達(dá)模式和功能。主要研究結(jié)果如下:1.桃小食心蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及嗅覺(jué)基因的鑒定本研究使用Illumina HiSeq4000平臺(tái)對(duì)桃小食心蟲雌雄觸角進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)嗅覺(jué)識(shí)別相關(guān)基因進(jìn)行鑒定,共鑒定了 29個(gè)OBPs基因、13個(gè)CSPs和52個(gè)氣味受體基因(包括1個(gè)Orco)。OBPs的氨基酸多重序列比對(duì)結(jié)果表明其中19個(gè)具有OBPs的典型特征。另外,除了 5個(gè)OBPs(OBP1、OBP4、OBP9、OBP20、OBP22)外,其余OBPs均具有信號(hào)肽。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,桃小食心蟲的GOBP3聚到了 GOBP1亞家族,而進(jìn)一步同源矩陣分析發(fā)現(xiàn)GOBP3與其他昆蟲的GOBP1有較高的一致性,平均一致性為65.2%,表明GOBP3可能與GOBP1有著類似的生物功能;熒光定量結(jié)果顯示OBP7特異性地在雌雄觸角中表達(dá),表明其可能在桃小識(shí)別性信息素、定位寄主植物和尋找合適產(chǎn)卵位點(diǎn)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用;而其余OBPs(OBP7、OBP9、OBP12、OBP15、OBP19、GOBP1、GOBP3、PBP2)除了在觸角中高表達(dá)外,在其他組織中也有表達(dá)。本研究所鑒定的13個(gè)CSPs均有CSPs序列motif(C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4),即具有4個(gè)保守的半胱氨酸。另外,信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)13個(gè)CSPs均具有完整的ORF,且均編碼信號(hào)肽序列。熒光定量結(jié)果表明在我們鑒定的3個(gè)CSPs(CSP1、CSP5、CSP12)中只有CSP5在觸角中特異性高表達(dá),表明CSP5可能在桃小嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用;值得注意的是CSP1和CSP12均在雄蟲的腹中高表達(dá),表明其可能在桃小的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要功能。對(duì)受體基因的跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示52個(gè)ORs的跨膜結(jié)構(gòu)為2-7個(gè),信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其均為信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。熒光定量檢測(cè)了 14個(gè)ORs(OR3、OR4、OR8、OR17、OR21、OR24、OR30、OR31、OR33、OR34、OR41、OR46、OR48、OR49)的表達(dá)譜,結(jié)果表明ORs不僅在觸角中高表達(dá),在其它組織中也有表達(dá)。其中9個(gè)ORs(OR4、OR17、OR21、OR24、OR34、OR46、OR48、OR49、GR8)在雌蟲觸角中的表達(dá)量顯著高于雄蟲觸角中,表明這幾個(gè)基因?qū)μ倚〈贫甓ㄎ患闹髦参锖蛯ふ耶a(chǎn)卵位點(diǎn)的過(guò)程有著重要作用;4個(gè)ORs(OR8、OR30、OR31、OR33)在雄蟲觸角中顯著性高表達(dá),表明其可能在識(shí)別性信息素過(guò)程中起關(guān)鍵作用。2.PBPs和GOBPs基因的分子克隆及功能分析首先通過(guò)RACE-PCR分子克隆得到PBPs和GOBPs基因,同時(shí)qRT-PCR轉(zhuǎn)錄水平和western蛋白水平檢測(cè)結(jié)果表明,PBPs和GOBPs基因在桃小雄蟲觸角中的表達(dá)量均顯著高于雌蟲。熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CsasPBP1和CsasPBP3主要識(shí)別Z-7-二十碳烯-11-酮,而CsasPBP2則主要負(fù)責(zé)識(shí)別Z-7-十九碳烯-11-酮,而除GOBP2外其余4個(gè)蛋白均與桃小的2種性信息素組分(Z-7-eicosene-11-one 和 Z-7-nonadecene-11-one)具有很強(qiáng)的結(jié)合能力,而只有 CsasPBP3 特異性地結(jié)合性信息素成分,CsasPBP1-2能夠與眾多的蘋果揮發(fā)物發(fā)生結(jié)合;GOBP1-2可以與寄主揮發(fā)物發(fā)生特異性結(jié)合。值得注意的是它們均與酯類化合物和烯類化合物有較強(qiáng)的結(jié)合能力,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這5個(gè)蛋白與6-7個(gè)碳原子的化合物結(jié)合力較弱。這表明碳鏈上的不飽和雙鍵存在以及碳鏈的長(zhǎng)度與否顯著地影響了化合物分子與蛋白的結(jié)合能力。
【圖文】：

圖丨－１昆蟲的嗅覺(jué)反應(yīng)及識(shí)別機(jī)制（Ｚｈｏｕ，邋２０１０）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｏｆ邋ｉｎｓｅｃｔ邋ｏｌｆａｃｔｉｏｎ邋（Ｚｈｏｕ，邋２０１０）逡逑１．４昆蟲嗅覺(jué)相關(guān)蛋白研究進(jìn)展逡逑１．４．１氣味結(jié)合蛋白逡逑普通氣味結(jié)合蛋白（Ｇｅｎｅｒａｌ邋Ｏｄｏｒａｎｔ邋Ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＧＯＢＰｓ）和性信息素結(jié)合蛋

味結(jié)合蛋白（０ＢＰ９、ＯＢＰ１５、０ＢＰ２１，Ｇ０ＢＰ１和ＰＢＰ２）均在雄性觸角中顯著性表達(dá)，，而２個(gè)氣逡逑味結(jié)合蛋白（０ＢＰ７和ＯＢＰ１９）雌性觸角顯著表達(dá)（圖２－３Ａ）；邋ＣＳＰｓ、ＳＮＭＰｓ和ＧＲｓ的分析結(jié)逡逑果表明均只有一個(gè)基因在雌雄觸角中顯著性表達(dá)，分別為ＣＳＰ１２、ＳＮＭＰ２和ＧＲ８邋（圖２－３Ｂ－Ｃ）。逡逑在ＯＲｓ的分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)ＯＲ２（Ｏｒｃｏ）在ｍＲＮＡ水平有著極高的表達(dá)，并且在雌雄觸角中的表達(dá)逡逑量相當(dāng)；另外，有３個(gè)ＯＲｓ邋（０Ｒ３１、ＯＲ３３和０Ｒ４１）在雄性觸角中顯著表達(dá)，然而有８?jìng)�(gè)ＯＲｓ逡逑（０Ｒ４、ＯＲ１７、ＯＲ２４、ＯＲ３０、ＯＲ３４、ＯＲ４６、ＯＲ４８邋和邋ＯＲ４９）呈現(xiàn)出與以上相反的結(jié)果（圖逡逑２－３Ｄ）。而在我們所鑒定的所有嗅覺(jué)基因中，８?jìng)�(gè)ＩＲｓ中均在雌雄觸角無(wú)顯著性差異（圖２－３Ｅ）；逡逑最后，我們發(fā)現(xiàn)在所有鑒定的候選基因中，ＧＲｓ的相對(duì)表達(dá)量最低（最大ＦＰＫＭ值＜４）。逡逑２．２．４氣味結(jié)合蛋白基因的鑒定及纟且織表達(dá)量分析逡逑在桃小食心蟲的觸角轉(zhuǎn)錄組中，共鑒別并注釋了邋２９個(gè)ＯＢＰｓ基因（包括２個(gè)ＧＯＢＰｓ和３個(gè)逡逑ＰＢＰｓ），其中除ＯＢＰ１和ＯＢＰ２３外，其余ＯＢＰｓ均具有完整的開放閱讀框ＯＲＦ，信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果逡逑表明有５個(gè)ＯＢＰｓ邋（ＯＢＰ１、ＯＢＰ４、０ＢＰ９、ＯＢＰ２０和ＯＢＰ２２）不具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)（表２－４）。根逡逑據(jù)ＯＢＰｓ蛋白的序列特征并與在其他淲翅目昆蟲己鑒定的ＯＢＰｓ氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，我們逡逑發(fā)現(xiàn)共有１９個(gè)ＯＢＰｓ屬于典型ＯＢＰｓ家族（圖２－４）
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S433

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2598661