【摘要】：背景與目的細(xì)胞液泡蛋白質(zhì)分選因子4 B(Vacuolar protein sorting 4B,VPS4B)是AAA ATP酶家族成員之一,在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸、溶酶體降解、病毒體出芽以及調(diào)節(jié)有絲分裂等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本課題組此前對(duì)一個(gè)牙本質(zhì)發(fā)育不良I型(Dentin dysplasia type I,DD-I)家系進(jìn)行外周血基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)其致病基因?yàn)閂PS4B,其次通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步闡述VPS4B基因通過(guò)Wnt通路調(diào)控牙齒的發(fā)育過(guò)程。為闡明該基因在牙齒發(fā)育過(guò)程中的詳細(xì)作用機(jī)制,構(gòu)建Vps4b基因敲除小鼠展開(kāi)進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用已成功構(gòu)建的Vps4b基因敲除小鼠模型,明確Vps4b基因在牙胚發(fā)育過(guò)程中的分布情況,并探討該基因突變對(duì)牙齒發(fā)育相關(guān)基因的影響,進(jìn)一步揭示該基因在牙齒致畸中的作用機(jī)制。材料與方法以CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建的Vps4b基因敲除小鼠模型為研究對(duì)象,采用定點(diǎn)交配的方式合籠,記錄懷孕時(shí)間。分別于懷孕13.5、14.5、16.5天斷頸處死孕鼠取胎鼠頭部及尾巴;于出生后2.5天和7天處死新生小鼠取下頜骨和尾巴。采用PCR技術(shù)鑒定胎鼠及新生幼鼠的基因型。將胎鼠頭部及幼鼠下頜骨石蠟包埋后獲取下頜第一磨牙牙胚組織切片,通過(guò)HE染色確定各組牙胚的發(fā)育時(shí)期,免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期的正常小鼠下頜第一磨牙牙胚中Vps4b、Dspp和Col-I的表達(dá)分布情況,并對(duì)比Vps4b基因敲除后小鼠牙胚中Vps4b、Dspp和Col-I的表達(dá)變化。結(jié)果PCR結(jié)果顯示子代小鼠基因型為Vps4b~(+/+)和Vps4b~(+/-)兩種。HE染色表明胚胎13.5、14.5、16.5天的小鼠下頜第一磨牙牙胚分別發(fā)育至蕾狀期、帽狀期和鐘狀期,出生后2.5天、7天牙胚處于分泌期和礦化期。正常小鼠免疫組織化學(xué)染色顯示:蕾狀期和帽狀期時(shí),Vps4b在牙胚中廣泛表達(dá),Dspp和Col-I均無(wú)表達(dá);鐘狀期Vps4b表達(dá)于內(nèi)、外釉上皮、牙乳頭和牙囊,Dspp在內(nèi)釉上皮和牙乳頭中表達(dá),Col-I表達(dá)于牙乳頭和牙囊;分泌期和礦化期Vps4b、Dspp和Col-I在成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙囊中均有表達(dá),牙乳頭亦可見(jiàn)Vps4b和Col-I的陽(yáng)性表達(dá)。小鼠基因突變后Vps4b在蕾狀期成釉器中變?yōu)殛幮员磉_(dá),在一些組織中表達(dá)強(qiáng)度變?nèi)?P0.05);Dspp在鐘狀期的牙乳頭和分泌期的牙囊中均未見(jiàn)表達(dá),在分泌期的成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞和礦化期牙囊中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P0.05);Col-I在鐘狀期、分泌期和礦化期的表達(dá)部位均無(wú)變化,僅在部分組織表達(dá)強(qiáng)度下降(P0.05)。結(jié)論在Vps4b~(+/+)小鼠發(fā)育過(guò)程中Vps4b表達(dá)于不同階段的牙胚中且隨著發(fā)育的進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度發(fā)生改變,說(shuō)明Vps4b可能參與了牙胚的正常發(fā)育。在Vps4b~(+/-)小鼠發(fā)育過(guò)程中Vps4b表達(dá)強(qiáng)度減弱,且牙齒發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá)下降,推測(cè)其可能通過(guò)調(diào)節(jié)自身及牙齒發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響牙齒的發(fā)育。
【圖文】：

小鼠Vps4bgDNA擴(kuò)增結(jié)果圖：A.以F1/R1為引物擴(kuò)增出2種條帶；B.以F1/R2

牙齒形態(tài)發(fā)生的功能[43]。（圖 4.2B）胚胎 16.5 天，，成釉器繼續(xù)生長(zhǎng)，內(nèi)釉上皮層向成釉器方向凹陷更深，其周?chē)?xì)胞繼續(xù)向間充質(zhì)生長(zhǎng)，形如吊鐘，稱(chēng)鐘狀期成釉器。在鐘狀期，成釉器包括四層細(xì)胞，即在帽狀期成釉器的基礎(chǔ)上在內(nèi)釉上皮層和星網(wǎng)狀層之間增加了中間層，此外內(nèi)釉上皮和外釉上皮交界處形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，牙胚失去與口腔上皮的聯(lián)系。此期牙齒形態(tài)已基本確定，隨著發(fā)育的繼續(xù)進(jìn)行內(nèi)釉上皮細(xì)胞和緊鄰的牙乳頭細(xì)胞發(fā)生相互誘導(dǎo)，分別分化為成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞。（圖 4.2C）出生后第 2.5 天，牙冠的未來(lái)形狀已確定，外釉上皮細(xì)胞逐漸退化，內(nèi)釉上皮細(xì)胞完全分化為高柱狀的成釉細(xì)胞并分泌有機(jī)基質(zhì)，鄰近的牙乳頭細(xì)胞分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞不斷分泌有機(jī)基質(zhì)，繼而發(fā)生礦化。因此期分泌大量的有機(jī)基質(zhì)，因而被稱(chēng)為分泌期，牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)是有規(guī)律的交叉形成的。內(nèi)釉上皮和外釉上皮在頸環(huán)部位增生，向未來(lái)根尖孔的方向生長(zhǎng)，形成赫特維希上皮根鞘。（圖 4.2D）出生后第 7 天，牙冠發(fā)育即將完成，由成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的基質(zhì)蛋白已礦化，可見(jiàn)一定厚度的牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)形成。（圖 4.2 E、F）
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2598514