【摘要】：菊花是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一,觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。目前切花菊主要通過集約化設(shè)施進(jìn)行連作栽培,設(shè)施中土壤次生鹽漬化嚴(yán)重影響菊花生產(chǎn)和品質(zhì)。因而培育耐鹽菊花新品種已成為切花菊育種的一個(gè)重要目標(biāo)。已有研究表明過量表達(dá)WRKY基因植株具有較強(qiáng)的抗鹽性同時(shí)植株的表型無缺陷。因此本研究對DgWRKY5基因進(jìn)行了分離和功能鑒定,同時(shí)對轉(zhuǎn)DgWRKY5菊花和非轉(zhuǎn)化菊花的差異基因進(jìn)行篩選,可以為通過基因工程培育菊花抗鹽優(yōu)良又無表型缺陷的作物新品種提供了一條新途徑,同時(shí)對DgWRKY5的抗鹽機(jī)制進(jìn)行了初步探討。主要研究結(jié)果如下:1.用Real-time PCR方法檢測了DgWRKY5在NaCl、ABA、GA和H_2O_2處理下的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)特性,以及在不同組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明DgWRKY5表達(dá)在各種脅迫下均被誘導(dǎo);且與其他組織相比,在葉片中觀察到更高的DgWRKY5表達(dá)量。2.選取了過表達(dá)DgWRKY5菊花的OE-17和OE-56株系和野生型菊花進(jìn)行NaCl處理開展抗鹽性鑒定。研究結(jié)果表明,鹽脅迫下,轉(zhuǎn)基因菊花的葉片未出現(xiàn)明顯的枯萎和泛黃,同時(shí)轉(zhuǎn)DgWRKY5菊花OE-17和OE-56的存活率顯著高于野生型(P0.05)。鹽脅迫下,轉(zhuǎn)DgWRKY5菊花的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性顯著高于野生型;同時(shí)二氧化氫(H_2O_2)、氧離子(O_2~-)和丙二醛(MDA)在轉(zhuǎn)基因菊花中的含量降低了,且DAB和NBT染色也比野生型淺。鹽脅迫下轉(zhuǎn)DgWRKY5菊花的根長、鮮重、葉綠素含量和葉片氣體交換參數(shù)等數(shù)據(jù)均優(yōu)于野生型。3.通過qRT-PCR測定了8個(gè)脅迫相關(guān)基因的相對表達(dá)量,初步探討DgWRKY5對鹽脅迫的分子調(diào)控機(jī)制。在轉(zhuǎn)DgWRKY5菊花中脅迫相關(guān)基因DgAPX,DgCAT,DgNCED3A,DgNCED3B,DgCuZnSOD,DgP5CS,DgCSD1和DgCSD2的表達(dá)上調(diào),從而提高了轉(zhuǎn)基因菊花的耐鹽性。4.運(yùn)用Illumina HiSeq對轉(zhuǎn)DgWRKY5菊花和野生型菊花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,共產(chǎn)生309068個(gè)長度大于200bp的轉(zhuǎn)錄本以及拼接成功153887個(gè)Unigene,總數(shù)據(jù)量14.26G。兩者共有1078個(gè)差異基因(qvalue0.005和|log2(foldchange)|≥1),其中上調(diào)基因593個(gè),下調(diào)基因485個(gè)。通過差異基因KEGG代謝通路分析,與非生物脅迫相關(guān)的上調(diào)代謝通路有:谷胱甘肽代謝、類胡蘿卜素生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、精氨酸和脯氨酸代謝等。用qRT-PCR對8個(gè)差異基因進(jìn)行基因表達(dá)水平驗(yàn)證。以上研究結(jié)果表明,本次研究的轉(zhuǎn)DgWRKY5菊花比野生型菊花更具耐鹽性,且DgWRKY5基因能通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量,調(diào)節(jié)活性氧清除酶的含量,提高葉片光合作用以及調(diào)節(jié)相關(guān)脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)等來增強(qiáng)菊花的耐鹽性。
【圖文】：

然后下降（圖 2-c）。H2O2在處理 12 小時(shí)后誘導(dǎo)了 DgWRKY5 的表達(dá)，隨后逐漸下降（圖 2-d）。而在 GA 處理期間，DgWRKY5 轉(zhuǎn)錄物逐漸積累，在 3 小時(shí)達(dá)到最大值并逐漸減少（圖 2-e）。這些結(jié)果表明 DgWRKY5 基因的表達(dá)在各種脅迫（NaCL,ABA, H2O2和 GA）下被誘導(dǎo)。

2.3.2 轉(zhuǎn) DgWRKY5 菊花的耐鹽性分析為了研究DgWRKY5的過表達(dá)是否增強(qiáng)了菊花的耐鹽性，培育了過量表達(dá)DgWRKY5的轉(zhuǎn)基因菊花株系，并且通過qRT-PCR檢測了8個(gè)轉(zhuǎn)基因系中的DgWRKY5的轉(zhuǎn)錄水平。如圖 3-a 所示，OE-17 和 OE-56 的 DgWRKY5 轉(zhuǎn)錄水平顯著（P <0.05）高于野生型，分別為野生型菊花的 3.5 和 2.6 倍。因此選擇 OE-17 和 OE-56 株系菊花進(jìn)行下一步的耐鹽性評估。在正常條件下，轉(zhuǎn)基因菊花和野生型菊花的表型沒有顯著差異，而在鹽脅迫下，與轉(zhuǎn)基因株系 OE-17 和 OE-56 相比，野生型植株的葉片有明顯的枯萎和泛黃，特別是在鹽脅迫的 10-15 天（圖 3-c，d）。在鹽脅迫后進(jìn)行兩周的恢復(fù)期，，僅有 35%的野生型存活，而 OE-17 株系有 88%的植株存活，OE-56 株系也有 78％的存活率，均超出了野生型一倍多（圖 3-b）。因此，對鹽脅迫下菊花的生理表型和存活率而言，轉(zhuǎn)基因株系比野生型植株顯示出了更強(qiáng)的鹽度耐受性。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S682.11

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 梁倩玉;菊花DgWRKY5基因的耐鹽性鑒定和轉(zhuǎn)錄組測序分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 田效琴;菊花DgWRKY5及DgWRKY4基因的克隆和功能鑒定[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

本文編號：2598042