【摘要】：黃瓜(Cucumis sativus L.)是設(shè)施蔬菜種植當(dāng)中不可缺少的經(jīng)濟(jì)作物之一。近些年,隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展,溫室大棚內(nèi)含重金屬的肥料、農(nóng)藥等的常年使用,黃瓜等蔬菜作物容易受到重金屬的污染。鎘(Cd)是重金屬污染中最為嚴(yán)重的元素之一,它通過食物鏈進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)后直接威脅人們的健康。因此,深入研究黃瓜耐Cd機(jī)制,加強(qiáng)耐Cd品種的選育,提高其抗逆性,對保證食品安全具有重要的意義。為了研究黃瓜耐Cd分子機(jī)制,本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析獲得了一個SDR家族基因CsNRSP。對其進(jìn)行克隆和表達(dá)分析,結(jié)合轉(zhuǎn)基因等技術(shù),從生理和分子生物學(xué)角度對CsNRSP進(jìn)行功能分析,初步闡述黃瓜耐Cd生理與分子機(jī)制,為進(jìn)一步將該基因用于黃瓜耐Cd品種的改良與選育提供試驗基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)本研究前期查閱了擬南芥等模式作物的相關(guān)文獻(xiàn),對Cd脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄組中的基因進(jìn)行分析,以生物信息學(xué)為方法,以文獻(xiàn)中基因的表達(dá)模式和與黃瓜同源基因的比對結(jié)果為依據(jù),對可能的黃瓜耐Cd基因進(jìn)行嚴(yán)格篩選,同時確保該基因在Cd等重金屬的有關(guān)功能尚且未知,初步確定了擬南芥中AtNRSP在黃瓜中的同源基因作為研究對象。然后利用DNAMAN軟件,對CsNRSP和AtNRSP的氨基酸序列進(jìn)行了比對分析,同源性為72%,序列的相似性可推斷功能也具有一定的相似性。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),與對照相比,CsNRSP在Cd脅迫條件下表達(dá)量明顯上調(diào)(4.45倍)。最終確定了AtNRSP在黃瓜中的同源基因CsNRSP作為試驗研究對象。該基因為一個新的Cd脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因。(2)該基因CDS序列全長為822 bp,編碼273個氨基酸,編碼蛋白質(zhì)分子量為29.02 kD,理論等電點為5.86,不穩(wěn)定系數(shù)為91.79,平均親水系數(shù)為0.016。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,CsNRSP與印度南瓜、桃、甜橙等12種植物NRSP蛋白有73%-93%的同源性,其中與甜瓜的蛋白同源性最高,為93%。(3)構(gòu)建植物過量表達(dá)載體,通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入野生型擬南芥,經(jīng)篩選獲得了3個陽性轉(zhuǎn)基因株系,分別對其進(jìn)行-Cd和50μM Cd處理,對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測和鑒定。結(jié)果顯示,Cd處理使得野生型根長顯著減少;而轉(zhuǎn)基因植株根長受Cd影響不大,其根長均大于對照。而在正常Cd處理條件下,轉(zhuǎn)基因植株根長與野生型長度沒有顯著差異。此外,Cd脅迫下野生型鮮重明顯降低,但過表達(dá)株系鮮重變化不大。(4)為探究CsNRSP在Cd脅迫下對植株光合作用的響應(yīng),本研究對葉綠素含量進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明:在無Cd的MS培養(yǎng)基上,野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的葉綠素含量基本一致,在含有50μM Cd的MS培養(yǎng)基上其含量都顯著減少,但轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的含量高于野生型。接著我們探究轉(zhuǎn)基因株系和野生型抗氧化酶活性變化,檢測其相關(guān)指標(biāo),結(jié)果表明:在正常MS培養(yǎng)基上,野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性基本一致,但是轉(zhuǎn)基因擬南芥株系酶的活性明顯高于野生型。(5)此外,Cd脅迫下轉(zhuǎn)基因株系中的Cd相關(guān)基因AtHMA4、AtMGT1、AtATM3和AtDWF4表達(dá)水平明顯高于野生型。這說明CsNRSP轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出的Cd耐受性可能由于這些基因編碼的蛋白質(zhì)的協(xié)同工作。上述結(jié)果表明CsNRSP過量表達(dá)能夠提高擬南芥的耐Cd能力。(6)通過侵染黃瓜子葉節(jié)完成了黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化,成功獲得黃瓜轉(zhuǎn)基因植株,為下一步利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育黃瓜耐Cd新品種奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

技術(shù)路線

M：2K DNA Marker；1：CsNRSP 基因M：Marker 2K；1：CsNRSP gene圖 3-3 CsNRSP 基因編碼區(qū) PCR 產(chǎn)物3 PCR results from coding regions of CsN分析
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S642.2

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本文編號：2597862