【摘要】：馬尾松是我國特有、分布面積最廣的針葉樹種,用途廣泛,在經(jīng)濟和生態(tài)上均具有重要的價值。該樹種具有良好的抗性,尤其以抗瘠薄見長,但至今有關馬尾松抗旱機制方面的研究卻鮮見報道。本論文主要研究了在植物抗旱性能方面起著重要作用的SnRK2基因家族的PmSnRK2.3、PmSnRK2.6a和PmSnRK2.6b三個基因,結果如下:(1)借助同源克隆技術和末端快速擴增技術(RACE)獲得三個基因(PmSnRK2.3、PmSnRK2.6a和PmSnRK2.6b)的完整cDNA序列,長度分別為2356bp、2059bp和1760bp,分別編碼了362、356和362個氨基酸。通過對三個基因編碼的蛋白質分別進行理化性質的分析與預測,結果顯示:PmSnRK2.3蛋白分子式為C_(1812)H_(2825)N_(495)O_(550)S_(16),分子量為40857.31Da;PmSnRK2.6a蛋白分子式為C_(1772)H_(2773)N_(481)O_(545)S_(16),分子量為40048.37Da;PmSnRK2.6b蛋白分子式為C_(1794)H_(2788)N_(488)O_(559)S_(21),分子量為40810.07Da;PmSnRK2.6b為不穩(wěn)定親水蛋白,其余兩者均為穩(wěn)定親水蛋白。(2)以成年馬尾松的各部位組織為材料進行實時熒光定量表達分析得出:PmSnRK2.3表達量最低的部位是新莖,表達量最高的部位是花,花中該基因的表達量約為老葉的1.34倍;PmSnRK2.6a表達量最低的部位是老莖,表達量最高的部位是花,花中該基因的表達量約為老葉的4.5倍;PmSnRK2.6b表達量最低的部位也是老莖,表達量最高的部位同樣是花,花中該基因的表達量約為老葉的2.9倍。結果顯示PmSnRK2.3、PmSnRK2.6a和PmSnRK2.6b三個基因在成年馬尾松各部位組織中均呈現(xiàn)不同程度的表達,其中花中的表達量最高,而莖則為表達量較低的組織。將30d的完整馬尾松幼苗,分別水培于10%pEG6000和ABA溶液中,取0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h和24h時間點的幼苗為材料,進行實時定量熒光分析表達得出:PEG6000處理下,在2h和24h時均出現(xiàn)波峰,表達量最高時約為0h的2.3倍,最低約為0h的1.1倍。ABA處理下,在1h和24h時均出現(xiàn)波峰,表達量最高是約為0h的2.8倍,最低時約為0h的1倍。(3)通過同源重組的方法構建了PmSnRK2.3的GUS融合表達載體,借助農(nóng)桿菌侵煙草的葉盤,獲得轉基因株系。通過基因組PCR檢測、GUS染色、表型分析、干旱模擬和生理指標測定等方法,分析野生型煙草與轉基因煙草的差異。干旱處理后,無論是植株的生長勢、葉片、根系等表型,還是生理指標測定分析,結果均顯示轉基因煙草的抗旱性能均強于對照組。本論文研究結果可為馬尾松抗旱機制的揭示、抗性基因的挖掘利用提供幫助。
【圖文】：

酸化水平[30]。AMPK 在高 AMP/ATP 的狀態(tài)下被 AMP 激活，也受到上游蛋白激酶AMP-activated protein kinase (AMPKK)的刺激而激活。經(jīng)過實驗探究得到結論：顯示在面對逆境脅迫時，哺乳動物細胞中所存在的活化 AMPK 是作出相應響應的啟動原件[31]。與前兩者不同的是，SnRK 廣泛存在于植物體中，在結構上具有保守性，并且根據(jù)基因家族成員的蛋白質結構的特點可以將其分為SnRK1、SnRK2和SnRK3三個亞家族[32]。其中，SnRK1亞家族與超家族中的 SNF1 和 AMPK 兩大家族在結構上具有一定的同源性，功能上也存在著相似性；SnRK2 和 SnRK3 則與之相反，并且僅存在于植物體中。研究報道指出，SnRK 蛋白激酶家族成員的 N 端存在特含一個蘇氨酸的激酶結構域，該區(qū)域可進行自我調(diào)節(jié)并具有較高的變化性。SnRK 蛋白激酶包括三個亞家族，每一個亞家族的結構特點各不相同，在功能上也有所差異[33]。三個亞家族均具有三個子結構，，一端是存在 Ser/Thr 這一蛋白激酶區(qū)域的結合域，另一端是一段可以進行自我調(diào)節(jié)或者自我抑制的序列[34]，中間片段銜接結合域和自我調(diào)節(jié)序列，具有調(diào)整異源三聚體復合體的形狀[35](圖 1.1)。

已知某酵母突變體中的 SNF1 無法正常表達，往該突變體中轉入黑麥的 SnRK1 基因并之表達。結果顯示，突變體 SNF1 執(zhí)行的功能得到恢復，即參與調(diào)控編碼糖代謝相關酶的基因可正常運作。并且，轉基因的酵母可利用乙醇和甘油等非發(fā)酵碳源[37]。在酵母突體中表達煙草 NtNPK5 基因，并將轉基因的突變體培養(yǎng)在含蔗糖的培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)該突體可以正常生長并含有轉化酶活性[39]。由此判斷植物的糖代謝機制可能與酵母類似，而nRK1 起到的信號傳導功能也與 SNF1 類似。而 NtNPK5 基因恢復 SNF1 酵母突變體正常長與葡萄糖調(diào)節(jié)路徑有關，進一步驗證了植物與酵母在糖信號傳導調(diào)節(jié)機制具有較高的似性[36]。在馬鈴薯塊莖中反義表達 SnRK1 基因，發(fā)現(xiàn)蔗糖合成酶基因的表達量和活性均現(xiàn)明顯下降的情況，而轉基因植株的葉片中，蔗糖含量增加，蔗糖合成酶基因的表達量不再隨之上升[40]。因此可以得出結論：SnRK1 對糖代謝的調(diào)控是通過直接參與蔗糖合成基因的表達調(diào)控來實現(xiàn)的(圖 1.2)。
【學位授予單位】：南京林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S791.248

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1 韋薔;馬尾松PmSnRK2s基因的克隆與功能分析[D];南京林業(yè)大學;2018年

本文編號：2596459