【摘要】：本研究利用實(shí)驗(yàn)室已有的吉林人參(Panax ginseng C.A.Meyer)248,993個(gè)unigenes轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),通過生物信息學(xué)方法挖掘及分析吉林人參可溶性焦磷酸酶基因(PgPpase)。預(yù)測(cè)可能對(duì)人參皂苷生物合成產(chǎn)生影響的PgPpase基因,并將PgPpase03-1基因與人參皂苷合成關(guān)鍵酶基因一同進(jìn)行表達(dá)分析,佐證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,并以番茄為受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,主要研究結(jié)果如下:1.篩選到126條PgPpase基因,其中25條具有完整開放閱讀框和保守結(jié)構(gòu)域,經(jīng)合并得到7個(gè)基因ID下的14條PgPpase基因,共預(yù)測(cè)到10個(gè)保守基序。2.系統(tǒng)進(jìn)化樹分為三大分支。其中PgPpase01-1、PgPpase07-1、PgPpase06-1、PgPpase06-5基因與海洋真核微藻(Ostreococcus tauri)、超微藻(Bathycoccus prasinos)和萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中Ppase基因聚集在一個(gè)分支上,表明這幾條PgPpase在人參中出現(xiàn)較早。3.表達(dá)量分析表明PgPpase02-3、PgPpase02-6、PgPpase03-1、PgPpase06-1和PgPpase06-5基因在任何組織、年生和農(nóng)家品種中都有較高表達(dá)量,其中PgPpase03-1基因的表達(dá)量最高。4.預(yù)測(cè)可能對(duì)人參皂苷合成產(chǎn)生影響的基因,得出PgPpase03-1基因最具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。5.PgPpase03-1基因的表達(dá)分析結(jié)果表明,不同激素處理下PgPpase03-1基因和關(guān)鍵酶基因均極顯著上調(diào)表達(dá),同時(shí)人參皂苷含量升高,佐證了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。6.以番茄為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,胚軸轉(zhuǎn)化率為5.7%-8.2%,子葉轉(zhuǎn)化率為11.0%-14.1%,獲得34株陽性番茄植株的T0代種子。
【圖文】：

水的三角形結(jié)構(gòu)[15]。Tuominen 等在 2007 年，又發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)具有復(fù)雜組成的亞家族即含有 CBS 結(jié)構(gòu)域的 S-PpaseⅡ(CBS-Ppase)[16]。大約四分之一的 S-PpaseⅡ中會(huì)含有由兩個(gè) CBS 結(jié)構(gòu)域組成的調(diào)節(jié)肽段，或還會(huì)有 DRTGG 結(jié)構(gòu)域(由保守的 Asp-Arg 和 Thr-Gly-Gly 基序而得名)插入到其中的一個(gè) CBS 結(jié)構(gòu)域中的現(xiàn)象(如圖 2)[16]。根據(jù)所有 CBS-Ppase 和典型 S-PpaseⅡ的結(jié)構(gòu)域的序列相似性和所有活性位點(diǎn)殘基的保守性，模擬產(chǎn)氣莢膜梭菌的 CBS-Ppase 全序列對(duì)應(yīng)的完整結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，此酶的催化部分和活性部分在空間上是相互獨(dú)立的，這就與它們分別存在但是都具有功能的事實(shí)相符合[17]。S-PpaseⅢ是鹵素脫氫酶的變體，鹵素脫氫酶 motifⅠ[DXDX(T/V)]中的第二個(gè) Asp 被 Trp 代替，，motifⅡ中的 Thr/Ser被 Gly 替代就產(chǎn)生了 S-Ppase Ⅲ[6]。

水解焦磷酸的速率常數(shù)大約為 200 s-1；S-PpaseⅡ中的典型 S-PpaseⅡ水解焦磷酸的速率常數(shù)大約為 104s-1，是所有類型的 S-Ppase 中催化活性最強(qiáng)的；S-Ppase Ⅲ；雖然能催化 PPi，但是速率常數(shù)大約卻只有 0.2 s-1。S-PpaseⅡ中的 CBS-Ppase 因含有調(diào)控插入片段而具備了自抑調(diào)控能力，所以催化活性比典型的 S-PpaseⅡ下降了 1-3 個(gè)數(shù)量級(jí)[20]。S-PpaseⅠ和 S-PpaseⅡ都需要 3 或 4 個(gè)二價(jià)金屬陽離子(通常為 Ca2+和 Mg2+)來輔助其完成催化作用，然而 S-PpaseⅡ還需要過渡金屬離子(如 Mn2、Co2+和 Ni2+)作為第二輔助因子參與催化過程才能達(dá)到最大活性[21]。研究表明 CBS-Ppase 更傾向于 Co2+作為第二輔助金屬離子[15,22]。S-Ppase Ⅲ同樣需要過度金屬離子作為第二輔助因子，在 pH 為 6，Ni2+存在時(shí)其達(dá)到最大活性[6]。S-PpaseⅠ還可以選擇性的催化 ATP 中的磷酸基團(tuán)水解釋放能量，當(dāng)過渡金屬離子的濃度達(dá)到鎂離子輔助 S-PpaseⅠ發(fā)揮功能的濃度的 1%時(shí)，就能催化 ATP 水解[23]，但是 S-PpaseⅡ在任何情況下，都不能催化 ATP 的水解[13]；相反 S-PpaseⅡ能催化三磷酸鹽和亞胺二磷酸鹽水解，催化速率比催化焦磷酸的速率低 104-105倍，但是 S-PpaseⅠ卻不能水解三磷酸鹽和亞胺二磷酸鹽[24]。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S567.51

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2596437