【摘要】：肌肉生長抑制素(MSTN)又被稱為GDF-8,是在1997年被發(fā)現(xiàn)的一種與骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)的負(fù)調(diào)控因子,其活性的降低或喪失,會引起動物肌肉的過度發(fā)育,表現(xiàn)為雙肌性狀。CRISPR/Cas9技術(shù)是由gRNA指導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶特異性識別基因靶位點并且進(jìn)行基因編輯的技術(shù)。CRISPR/Cas9技術(shù)擁有很多優(yōu)勢,但是也有脫靶的弊端。本實驗所用的質(zhì)粒CRISPR/Cas9-B,包含針對牛MSTN基因第二外顯子而設(shè)計的gRNA,可以引導(dǎo)Cas9蛋白作用于AGAACCAGGAGAAGATGGACTGG位點。然而通過檢索,我們發(fā)現(xiàn)除了牛2號染色體上的打靶位點,在4號染色體receptor-type tyrosine-protein phosphatase N2的5’端有17個堿基與gRNA匹配,1號染色體leukocyte immunoglobulin-like receptor的5’端有14個堿基與gRNA匹配,10號染色體kinectin isoform X7的5’端有16堿基與gRNA匹配,這些位點均為潛在脫靶點。為了檢測脫靶效率,我們在這些位點兩端分別設(shè)計引物用于PCR檢測。為降低CRISPR/Cas9的脫靶效率,分別設(shè)計了截短1 bp、2 bp、3 bp和5 bp的gRNA,利用這些截短的gRNA構(gòu)建CRISPR/Cas9質(zhì)粒,分別命名為CRISPR/Cas9-19、CRISPR/Cas9-18、CRISPR/Cas9-17和CRISPR/Cas9-15。使用電轉(zhuǎn)染的方法將這些質(zhì)粒分別導(dǎo)入牛胎兒成纖維細(xì)胞中,利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行單細(xì)胞分離,并在96孔板內(nèi)培養(yǎng),以此獲得基因敲除的細(xì)胞株。提取基因組,進(jìn)行PCR擴增和電泳檢測,將有目的條帶的樣品進(jìn)行測序分析。最后比較截短1 bp、2 bp、3 bp、5 bp的g RNA所構(gòu)建的CRISPR/Cas9質(zhì)粒與CRISPR/Cas9-B質(zhì)粒在打靶和脫靶位點的作用效率。結(jié)果顯示,在MSTN打靶位點CRISPR/Cas-B、CRISPR/Cas9-19、CRISPR/Cas9-18、CRISPR/Cas9-17和CRISPR/Cas9-15引起基因突變的效率分別為62.16%、17.39%、7.69%、74.29%和3.85%;在4號染色體脫靶位點(2號引物)的作用效率分別為52.86%、0、0、8.82%和0;在1號染色體脫靶位點(9號引物)的效率分別為44.87%、51.72%、86.36%、0和50%;在10染色體脫靶位點(26號引物)的作用效率都為0。CRISPR/Cas9-17質(zhì)粒在MSTN位點引起基因突變的效率比CRISPR/Cas9-B質(zhì)粒的效率高,同時在三個脫靶位點的作用效率有明顯降低,并且在統(tǒng)計學(xué)上有極顯著差異(P0.01)。CRISPR/Cas9-17質(zhì)粒達(dá)到了在不影響目的基因打靶效率的同時減小了脫靶現(xiàn)象的目的。本研究成功地在牛胎兒成纖維細(xì)胞敲除了牛MSTN基因,同時通過截短gRNA長度使CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶問題得以改善,使CRISPR/Cas9技術(shù)在牛羊育種領(lǐng)域能更好的發(fā)揮作用,為家畜和畜牧育種帶來更大的機遇。
【圖文】：

圖 1.1 Cas9 和 FokI-Cas9/gRNA 融合變體的體系結(jié)構(gòu)[27]Figure 1.1 Architectures of Cas9 and FokI-Cas9/gRNA fusion variants[27]3.2 打破 PAM 的結(jié)構(gòu)限制對 CRISPR/Cas9 打靶效率的優(yōu)化FokI 核酸酶（RFNs）的切割依賴于二聚體 RNA（兩個 gRNA）的引導(dǎo)，和方向上的嚴(yán)格限制，即需要兩個 gRNA 共同定位。但是此復(fù)合體不僅僅是在的優(yōu)勢，，還包括所需要的有效基因組編輯活動。這些新核酸酶能夠在人類細(xì)胞導(dǎo)基因組編輯。二聚體 RNA 引導(dǎo) FokI 核酸酶（RFNs）識別擴展序列和高效率的內(nèi)源性基因，并且可以通過敏感的深度測序方法判斷，脫靶突變效率已經(jīng)降的水平，但是符合 fCas9 復(fù)合物要求的靶位點數(shù)目有所減少。所以在設(shè)計引導(dǎo)體時，如果使用原有結(jié)構(gòu)的 gRNA 會導(dǎo)致 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的靶向范圍非常5’末端的 G 核苷酸的要求和 gRNA 對 5’-NGG 的 PAM 序列的要求限制了靶向可以改變 gRNA 和 dCas9 對 5’G 的需求，那么靶位點的范圍將提高 16 倍[28]

CRISPR/Cas9質(zhì)粒Figure2.2CRISPR/Cas9vector
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78;S823

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 尹煜鵬;袁繼行;孫樹漢;;CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報;2018年02期

2 梁奔夢;狄冉;劉秋月;王翔宇;胡文萍;儲明星;;CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其影響因素[J];中國畜牧雜志;2017年08期

3 尹s

本文編號：2590951