【摘要】：水楊酸甲酯(MeSA)是廣泛存在于食物、飲料和藥劑中的一種特殊香料,它是一種有機(jī)酯類,可以釋放花香類揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)。這些有機(jī)化合物存在于許多植物中,尤其是在冬青植物,在植物防御機(jī)制中飾演著重要的角色。茶是世界上最受歡迎的飲品之一,由于不同的茶樹(shù)品種、萎凋時(shí)間和揉捻程度,不同茶類的香氣有很大的區(qū)別。這些VOCs在茶葉中的含量雖然很少,但是對(duì)茶葉的香氣和品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。MeSA是賦予茶葉高品質(zhì)的茶葉香氣和滋味重要的化合物之一。前期研究表明,相對(duì)于其他茶類,白茶含有較高含量的MeSA。本文以白茶萎凋過(guò)程中香氣化合物水楊酸甲酯的變化作為啟發(fā)點(diǎn),研究鑒定了茶樹(shù)中催化MeSA合成的一個(gè)新的SAMT(水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶)基因CsSAMT。從茶樹(shù)葉片cDNA中成功克隆、并使用大腸桿菌和釀酒酵母對(duì)CsSAMT酶活力進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)通過(guò)生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子克隆、DNA全長(zhǎng)分析、熒光實(shí)時(shí)定量等對(duì)CsSAMT功能和表達(dá)特征進(jìn)行研究。研究結(jié)果對(duì)茶葉香氣的形成、優(yōu)化和調(diào)控賦予了新的認(rèn)識(shí),對(duì)提高白茶的香氣品質(zhì)具有積極意義。主要研究結(jié)果如下:(1)通過(guò)SDE和GC-MS方法對(duì)白茶萎凋過(guò)程中MeSA含量進(jìn)行檢測(cè),實(shí)驗(yàn)表明MeSA在白茶萎凋過(guò)程中隨萎凋時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)線性增長(zhǎng)趨勢(shì)。其中萎凋時(shí)間為6 h、12h、24 h和36 h時(shí)MeSA的含量逐步穩(wěn)定上升,在72 h時(shí),樣品中MeSA的含量突然急劇增加是36 h茶葉樣品的2.5倍。(2)通過(guò)RT-PCR方法從茶樹(shù)葉片cDNA中克隆得到一段開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1104 bp的序列,通過(guò)生物信息學(xué)比對(duì)后,命名為CsSAMT(GenBank:No.MG459470),該序列編碼367個(gè)氨基酸,理論蛋白分子量和等電點(diǎn)為41297.38Da和5.224,GC含量為43.03%;系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示CsSAMT與其他植物SAMTs同源性在42% 100%之間,與山茶的SAMT同源性最高。經(jīng)原核表達(dá)及真核表達(dá)后,對(duì)重組蛋白CsSAMT進(jìn)行酶促反應(yīng),通過(guò)GC-MS進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)表明CsSAMT能夠催化水楊酸(SA)生成MeSA,且該蛋白具有較強(qiáng)的底物特異性。(3)運(yùn)用Gateway方法構(gòu)建含有加強(qiáng)型熒光報(bào)告基因(EGFP)重組載體CsSAMT,導(dǎo)入農(nóng)桿菌,將其注射入煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察表明CsSAMT定位于葉綠體。(4)從茶樹(shù)葉片基因組中克隆得到6342 bp的CsSAMT的DNA序列,經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)含有四個(gè)外顯子區(qū)和三個(gè)內(nèi)含子區(qū),與已知的N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因家族的DNA序列結(jié)構(gòu)相似。通過(guò)Genome walking方法克隆得到2012 bp的CsSAMT的啟動(dòng)子片段,通過(guò)PlantCARE在線軟件分析后表明該DNA序列具有啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄元件并含有一些特殊的順式元件,影響并調(diào)節(jié)CsSAMT基因的轉(zhuǎn)錄。(5)CsSAMT熒光定量PCR分析表明該基因在幼嫩葉片中表達(dá)量較高,芽和第一葉的表達(dá)量大致相同,第二葉表達(dá)量最高,而莖和根中表達(dá)量較低(以老葉的表達(dá)量為對(duì)照)。第二葉的表達(dá)量約是芽和第一葉的1.5倍,約是莖和根的4倍和8倍。
【圖文】：

的生物合成一直未被報(bào)道。根據(jù)已知的研究表明，水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶能夠催化SA生成MeSA，這種甲基化反應(yīng)由S-腺苷甲硫氨酸依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生。（如圖2-1）近年來(lái)，植物中SAMTs基因逐漸被研究，但在茶樹(shù)中的SAMT和白茶中MeSA的產(chǎn)生一直未被報(bào)道。為了驗(yàn)證茶樹(shù)中CsSAMT基因在茶葉形成香氣過(guò)程中的酶學(xué)特性，研究了白茶在萎凋處理過(guò)程中MeSA含量的變化，并將CsSAMT基因從茶樹(shù)中克隆得到，對(duì)其進(jìn)行酶活驗(yàn)證、生物學(xué)信息分析、亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子克隆、DNA全長(zhǎng)分析、熒光實(shí)時(shí)定量等初步分析。本文中有關(guān)白茶香氣形成的分子機(jī)制和相關(guān)基因的研究，將對(duì)茶葉香氣的形成、優(yōu)化和調(diào)節(jié)具有新的認(rèn)識(shí)，，對(duì)提高茶葉尤其是白茶的品質(zhì)具有重要意義。

/苯丙素類化合物部分合成途徑示意圖。紅色區(qū)域顯示地為水楊酸合成水楊酸甲酯的生artial pathway for the biosynthesis of phenylpropanoid/benzenoids and the red box indicatebiosynthesis of methyl salicylic from salicylic acid路線驗(yàn)以白茶萎凋過(guò)程中特殊香氣化合物水楊酸甲酯的生理變化（如點(diǎn)，研究鑒定茶樹(shù)中一個(gè)新的 SAMT 基因 CsSAMT。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S571.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2590881