【摘要】：試驗(yàn)?zāi)康?探究microRNA-708(miR-708)靶向調(diào)控LEF1基因介導(dǎo)Wnt信號(hào)通路對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞的增殖、EMT和凋亡的調(diào)控機(jī)制。試驗(yàn)方法:(1)細(xì)胞株篩選 試驗(yàn)選用4種黑色素瘤細(xì)胞株B16、A375、WM239和WM451,培養(yǎng)后,提取細(xì)胞的總RNA后,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,并設(shè)計(jì) miR-708、U6 的 PCR 引物,運(yùn)用 qRT-PCR(Quantitative real time polymerse chain reacton,定量即時(shí)聚合酶連鎖反應(yīng))方法,以U6為參照,檢測(cè)miR-708在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況,選擇相對(duì)表達(dá)最高的B16黑色素瘤細(xì)胞株用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。(2)小鼠黑色素瘤模型及各指標(biāo)表達(dá)情況 最佳黑色素瘤細(xì)胞株確定后,選擇清潔級(jí)雄性昆明種小鼠40只用于試驗(yàn)。試驗(yàn)動(dòng)物分為正常組和模型組:模型組小鼠用眼科剪小心剪去左后肢內(nèi)側(cè)鼠毛,消毒后,抽取預(yù)先制備的黑色素瘤細(xì)胞單細(xì)胞懸液0.2 mL,接種于小鼠左后肢內(nèi)側(cè)皮下,待接種的瘤細(xì)胞成瘤直徑達(dá)到約0.6 cm時(shí),處死動(dòng)物,剝離腫瘤塊;正常組不接種黑色素瘤細(xì)胞,其它操作方法和過程相同。①所取組織用HE染色法染色,進(jìn)行病理觀察。同時(shí),用免疫組化方法檢測(cè)LEF1蛋白表達(dá)陽性率,在高倍顯微鏡下進(jìn)行陽性細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù),計(jì)算平均陽性表達(dá)率。②運(yùn)用前述qRT-PCR檢測(cè)方法,分別設(shè)計(jì)miR-708、U6、LEF1、β-catenin、Wnt3a、bcl-2、N-cadherin、Bax、Caspase3、E-cadherin 和 GAPDH 的 PCR 引物,以U6為miR-708的相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)的內(nèi)參,以GAPDH為L(zhǎng)EF1、β-catenin、Wnt3a、bcl-2、N-cadherin、Bax、Caspase3、E-cadherin 相對(duì)表達(dá)水平的內(nèi)參,檢測(cè)了兩組組織中相關(guān)mRNA的表達(dá)水平,并進(jìn)行比較分析。③正常組和模型組中 LEF1、β-catenin、Bcl-2、Bax、Caspase3、Wnt3a、E-cadherin、N-cadherin相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)則采用Western blot方法。試劑盒提取總蛋白后,進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜,并使蛋白質(zhì)與各自的特異性抗體結(jié)合,最后使用HRP標(biāo)記的二抗檢測(cè)確定最終含量。(3)靶向關(guān)系驗(yàn)證及細(xì)胞試驗(yàn) 在細(xì)胞及分子試驗(yàn)水平上,生物信息學(xué)網(wǎng)站和雙熒光素酶報(bào)告方法對(duì)miR-708與LEF1的靶向關(guān)系進(jìn)行確認(rèn),并將細(xì)胞進(jìn)行分組試驗(yàn):Control組為正常細(xì)胞組;Blank組則不轉(zhuǎn)染任何序列;NC組為陰性對(duì)照,轉(zhuǎn)染miR-708陰性對(duì)照序列;miR-708 mimics組轉(zhuǎn)染了可增強(qiáng)miR-708表達(dá)的 miR-708 mimics;miR-708 inhibitors組 轉(zhuǎn)染了 可抑制 miR-708 表達(dá)的miR-708 inhibitors;siRNA-LEF1 組轉(zhuǎn)染 了干擾 LEF 的表達(dá)的 siRNA-LEF1;miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1組轉(zhuǎn)染了僅能抑制miR-708表達(dá)又能干擾LEF表達(dá)的 miR-708 inhibitors 和 siRNA-LEF1。①靶向關(guān)系確定:通過生物學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)microRNA.org進(jìn)行了 miR-708的靶基因分析,并驗(yàn)證LEF1是否為miR-708的直接靶基因。②同樣地,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,使用qRT-PCR檢測(cè)方法對(duì)7組細(xì)胞中的miR-708、LEF1、β-catenin、Wnt3a、bcl-2、N-cadherin、bax、E-cadherin 及 Caspase3 等相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定,并進(jìn)行分析比較。③再使用Western blot檢測(cè)方法對(duì)7組細(xì)胞中的miR-708、LEF1、β-catenin、Wnt3a、bcl-2、N-cadherin、bax、E-cadherin 及 Caspase3 等蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定,并進(jìn)行分析比較。④MTT試驗(yàn):細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48h后,以每孔3×103～6×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng),然后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各組細(xì)胞570 nm處吸光度值(OD值),以O(shè)D值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞活力曲線圖,測(cè)定了轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的增殖能力。⑤劃痕試驗(yàn):細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,分別接種各組細(xì)胞到6孔板,培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)90%～100%時(shí),進(jìn)行劃痕試驗(yàn),檢測(cè)各組細(xì)胞遷移情況。⑥Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況。⑦細(xì)胞周期與凋亡情況檢測(cè):細(xì)胞周期觀察和細(xì)胞凋亡情況的測(cè)定使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行,細(xì)胞周期在488 nm處熒光下檢測(cè),凋亡細(xì)胞檢測(cè)則以488 nm波長(zhǎng)為激發(fā)光,525 nm、620 nm下檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果:(1)細(xì)胞株篩選 通過選用4種黑色素瘤細(xì)胞株B16、A375、WM239和WM451進(jìn)行試驗(yàn)并進(jìn)行測(cè)定后,結(jié)果顯示miR-708在4種黑色素瘤細(xì)胞株中均有不同程度的表達(dá),比較結(jié)果中,miR-708在B16中的表達(dá)量最高,且明顯高于其它3中黑色素瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平(P0.05)。因而后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)選擇高miR-708表達(dá)的B16黑色素瘤細(xì)胞株進(jìn)行操作。(2)小鼠黑色素瘤模型①建立小鼠黑色素瘤模型后,分別進(jìn)行正常組和模型組的組織HE染色及病理學(xué)觀察,結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組細(xì)胞大小不一,體積較大,形狀不規(guī)則,僅少部分細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見黑色素顆粒。組織內(nèi)可見較大片壞死,黑色素瘤間質(zhì)及周圍組織內(nèi)見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí),LEF1蛋白在正常組中的表達(dá)陽性率為(20.31 ±5.28)%,明顯低于模型組中的(65.35 ±6.85)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果說明受到腫瘤的影響,B16黑色素瘤細(xì)胞模型組小鼠LEF1蛋白表達(dá)量增加,明顯高于正常組的LEF1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果也說明LEF1參與了黑色素瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程。②根據(jù)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果,與正常組相比,模型組miR-708、Bax、Caspase3、E-cadherin 相關(guān)基因 mRNA 表達(dá)水平顯著降低,而 LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平顯著升高。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜ 0.05)。③根據(jù)Western blot檢測(cè)結(jié)果,與正常組相比,模型組Bax、Caspase3、E-cadherin 表達(dá)水平顯著降低,LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 表達(dá)水平顯著升高。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果也證明了 miR-708以及Bax、Caspase3、E-cadherin、LEFl、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 等相關(guān)基因和蛋白與黑色素瘤細(xì)胞的形成和發(fā)展密切相關(guān)。(3)靶向關(guān)系驗(yàn)證及細(xì)胞試驗(yàn)①靶向關(guān)系確定:通過生物學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)microRNA.org進(jìn)行了 miR-708的靶基因在線分析結(jié)果,LEF1基因序列與miR-708序列間存在特異結(jié)合區(qū)域,LEF1是miR-708的靶基因。同時(shí),根據(jù)熒光素酶報(bào)告法檢測(cè)結(jié)果及比較結(jié)果可看出:與NC組比較,miR-708 mimics轉(zhuǎn)染組中野生型Wt-miR-708/LEF1共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶信號(hào)下降(P0.05);而突變型3'UTR的熒光素酶活性無明顯差異(P0.05),說明miR-708能特異結(jié)合LEF1基因。②對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組的相關(guān)mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定分析,結(jié)果顯示:與 Control 組相比,其余各組 miR-708、Bax、Caspase3、E-cadherin 的 mRNA 表達(dá)顯著降低(均P＜0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 的 mRNA表達(dá)顯著升高(均P＜0.05)。與Blank和NC組比較,miR-708 mimics組和siRNA-LEF 1 組 Bax、Caspase3、E-cadherin 的 mRNA 表達(dá)量顯著增加(均 P0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 的 mRNA 表達(dá)量顯著降低(均 P0.05)。與Blank和NC組比較,miR-708 mimics組miR-708表達(dá)顯著增加(均P0.05),siRNA-LEFl 組 miR-708 表達(dá)無明顯差異(P0.05)。與 Blank 和 NC組比較,轉(zhuǎn)染 miR-708 inhibitors 組 miR-708、Bax、Caspase3、E-cadherin 的 mRNA表達(dá)量顯著降低(均 P＜ 0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin的mRNA表達(dá)量顯著增加(均P0.05)。與Blank和NC組比較,miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1 組細(xì)胞中 miR-708 表達(dá)量顯著降低(P0.05),而 Bax、Caspase3、E-cadherin、LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 的 mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。③ 相應(yīng)的,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果為:與Control組相比,其余組Bax、Caspase3、E-cadherin 的蛋白表達(dá)顯著降低(均P＜0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin的蛋白表達(dá)顯著升高(均P0.05)。Blank和NC組相比無明顯差異(P0.05)。與 Blank 和 NC 組比較,miR-708 mimics 組和 siRNA-LEF1組Bax、Caspase3、E-cadherin的蛋白表達(dá)量顯著增加(均P＜0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin的蛋白表達(dá)量顯著降低(均P0.05)。與Blank 和 NC 組比較,轉(zhuǎn)染 miR-708 inhibitors 組 Bax、Caspase3、E-cadherin 的蛋白表達(dá)量顯著降低(均 P＜0.05),LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin的蛋白表達(dá)量顯著增加(均P＜ 0.05)。與Blank和NC組比較,miR-708 inhibitors+ siRNA-LEF1 組細(xì)胞中 Bax、Casβase3、E-cadherin、LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin的蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。④MTT試驗(yàn)結(jié)果:與Control組相比,其余各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h及72h的OD值均明顯升高(均P0.05),細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。與Blank組和NC組相比,miR-708 inhibitors組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h及72h的OD值明顯升高(均P0.05);而miR-708 mimics 組、siRNA-LEF 1 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染 48h 及 72h 的 OD 值降低(均P0.05);miR-708 inhibitors +siRNA-LEFl 組則無明顯變化(P ＞0.05)。⑤劃痕試驗(yàn)結(jié)果:Blank組與NC組遷移能力比較無明顯差異(P0.05)。與Blank組和NC組相比,miR-708 mimics組和siRNA-LEF1組細(xì)胞遷移能力都顯著減弱(均P0.05),miR-708 inhibitors組遷移能力顯著增強(qiáng)(P ＜ 0.05),miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1 組細(xì)胞遷移能力變化不明顯(P0.05)。⑥Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況及結(jié)果:Blank組與NC組侵襲能力比較無明顯差異(P＞0.05)。與Blank組與NC組相比,miR-708 mimics組以及siRNA-LEF1組細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P0.05),miR-708 inhibitors組侵襲能力顯著增強(qiáng)(P0.05),miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1組細(xì)胞遷移能力差異不顯著(P0.05)。⑦細(xì)胞周期情況:與Control組相比,Blank組、NC組、miR-708 mimics組、siRNA-LEF1 組、miR-708 inhibitors 組、miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1 組周期改變主要表現(xiàn)在G0/G1期縮短和S期延長(zhǎng)(均P ＜ 0.05)。與Blank組和NC組相比,miR-708 mimics組、siRNA-LEF1組表現(xiàn)在G0/G1期延長(zhǎng)和S期縮短;miR-708 inhibitors 組表現(xiàn)在 G0/G1 期縮短和 S 期延長(zhǎng)(P0.05);miR-708 inhibitors + siRNA-LEF1 組無明顯差異(P ＞ 0.05)。⑧細(xì)胞凋亡情況:與Control相比,Blank組、NC組、miR-708 mimics組、miR-708 inhibitors 組、siRNA-LEF1 組、miR-708inhibitors +siRNA-LEF1 組細(xì)胞凋亡率依次呈顯著下降趨勢(shì),差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)。與Blank組與NC組相比,miR-708 inhibitors組細(xì)胞凋亡呈下降趨勢(shì),miR-708 mimics、siRNA-LEF 1 組細(xì)胞凋亡呈上升趨勢(shì)(P0.05),miR-708 inhibitors +siRNA-LEF1組細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。試驗(yàn)結(jié)論:miR-708、LEF1、Bax、Caspase3、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin等相關(guān)基因和蛋白參與了黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞周期及凋亡調(diào)控過程,對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過程中造成重要影響。miR-708、Bax、Caspase3、E-cadherin相關(guān)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與黑色素瘤發(fā)展有負(fù)向關(guān)系,LEF1、β-catenin、Bcl-2、Wnt3a、N-cadherin 相關(guān) mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與黑色素瘤發(fā)展有正向關(guān)系。同時(shí),在LEF1基因序列上具有miR-708特異結(jié)合的片段,LEF1基因是miR-708的特異性靶點(diǎn)。miR-708可抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖、EMT,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制與其靶向調(diào)控LEF1基因表達(dá),介導(dǎo)Wnt信號(hào)通路相關(guān)作用有關(guān)。
【圖文】：

下：ＡＡＣｔ＝［Ｃｔ（Ｂ＿Ｈ）－Ｃｔ（娜榞）］頭－［Ｃｔ（Ｂ~彛紓茫簦芑潁蒎義隙哉兆欏ｅ義希玻玻賜臣蒲荽礤義纖惺菥捎茫櫻校櫻渝澹玻保巴臣蒲砑ǎ櫻校櫻櫻茫瑁椋悖幔紓錚澹桑歟歟椋睿錚椋螅�，Ｕ蚜）进辶x閑寫恚屏孔柿喜捎鎂

本文編號(hào)：2590714