【摘要】：國際上對石磺科貝類的系統(tǒng)分類研究開始較早,國內(nèi)對石磺的研究已從形態(tài)分類研究擴展到系統(tǒng)進化及資源利用等方面。角質(zhì)層位于皮膚的表面,是生物防御外界物理傷害和化學(xué)傷害的重要屏障。本研究選取有代表性的以陸棲為主的瘤背石磺和以水棲為主的里氏擬石磺的背部皮膚為研究對象,對皮膚為適應(yīng)環(huán)境表現(xiàn)出蛋白質(zhì)層面的差異做進一步探索;通過對兩種石磺背部組織染色觀察和蛋白質(zhì)組測定分析,得到兩種背部皮膚組織結(jié)構(gòu)差異明顯的石磺在蛋白層面的差異、相關(guān)蛋白篩選與功能驗證及基因表達(dá)分析結(jié)果:(1)兩棲性生物皮膚對自身生存和適應(yīng)棲息地的環(huán)境變化起著無可替代的作用,從兩種石磺背部皮膚組織切片的TUNEL染色觀察到瘤背石磺背部凋亡信號多于里氏擬石磺,且凋亡信號多集中分布靠近表皮部位,背部乳頭狀突起,凋亡信號明顯。推測里氏擬石磺明顯的蛻皮現(xiàn)象要求不斷有新的細(xì)胞生成,瘤背石磺背部皮膚雖不蛻皮但同樣有細(xì)胞分裂分化現(xiàn)象,從而機體為了維持體內(nèi)細(xì)胞平衡狀態(tài),誘導(dǎo)大量細(xì)胞凋亡信號的發(fā)生。(2)采用Label-free非標(biāo)定量研究方法,對瘤背石磺和里氏擬石磺背部皮膚組織進行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定及分析,鑒定得到較多的是膠原家族蛋白,說明石磺科貝類有較高的營養(yǎng)價值,經(jīng)濟價值潛力突出;差異分析得出兩種石磺嘌呤代謝通路有較多的差異表達(dá)同源序列。定量分析顯示,兩種石磺背部皮膚差異同源蛋白種類和數(shù)量均較多,差異同源蛋白與其不同性狀聯(lián)系緊密,同時參與多種通路的分子調(diào)控中。差異蛋白中維生素C和富含血紅素的白蛋白在里氏擬石磺背部皮膚中高表達(dá),這類蛋白在里氏擬石磺背部皮膚的呼吸作用和滲透壓調(diào)節(jié)等功能中發(fā)揮重要作用。其中差異同源蛋白多富集在糖酵解/糖質(zhì)新生和丙酮酸代謝通路,糖酵解/糖質(zhì)新生通路存在較多差異同源序列,表明兩種石磺背部組織能量代謝過程存在差異,數(shù)據(jù)分析顯示糖酵解/糖質(zhì)新生過程關(guān)鍵酶己糖激酶在里氏擬石磺中高表達(dá),能夠保證充分的能量供應(yīng)、促進細(xì)胞增殖,可知里氏擬石磺背部皮膚糖酵解能力較強,與蛻皮(角質(zhì)膜更換)頻繁,需要較多的能量支持和較快的細(xì)胞增殖現(xiàn)象相關(guān)。瘤背石磺背部皮膚角質(zhì)化程度較高,脂質(zhì)基質(zhì)的主要成分神經(jīng)酰胺類物質(zhì)在瘤背石磺中高表達(dá),神經(jīng)酰胺是各種細(xì)胞因子和生長因子信號通路重要的第二信使,并且在皮膚滲透壓調(diào)節(jié)通路中發(fā)揮重要作用,對皮膚保濕有重要貢獻(xiàn),是瘤背石磺適應(yīng)陸棲生活的一個重要體現(xiàn)。在細(xì)胞凋亡功能富集中發(fā)現(xiàn),與促進細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白在里氏擬石磺背部皮膚中高表達(dá),與TUNEL染色法觀察到里氏擬石磺背部組織凋亡信號較弱現(xiàn)象吻合。兩種石磺背部嘌呤代謝通路存在較多的差異同源序列,在動物從水生到陸生的進化過程中,尿素酶基因在陸生動物中完全消失,或蛋白失去活性;兩種石磺的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組差異分析顯示,尿素酶基因和蛋白在瘤背石磺中高表達(dá),前期實驗證明里氏擬石磺分泌的粘液中尿素含量遠(yuǎn)高于瘤背石磺,說明瘤背石磺在嘌呤代謝通路產(chǎn)生的尿素大部分被尿素酶分解,更偏向于水棲生物的特征,屬于特殊物種,推測是與受到外界刺激時瘤背石磺以分泌粘液和散發(fā)出刺激性氨氣為主,而里氏擬石磺以噴射粘液為主的現(xiàn)象相關(guān)。(3)采用RACE方法,首次于瘤背石磺中得到Os-PAK2、Os-14-3-3序列全長,在里氏擬石磺中得到Pr-14-3-3序列全長。Os-PAK2氨基酸位置29-64是典型的PBD(P21結(jié)合位點),位置222-473是絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu),具有自我磷酸化調(diào)控作用,是調(diào)節(jié)PAK活性的主要部位。熒光定量分析顯示,瘤背石磺PAK2背部組織的表達(dá)量在mRNA和蛋白質(zhì)水平均高于里氏擬石磺,結(jié)合TUNEL染色結(jié)果,推測瘤背石磺背部皮膚組織中Os-PAK2促進凋亡的作用更加明顯。瘤背石磺各組織中Os-14-3-3的qRT-PCR定量分析顯示,在腸道和神經(jīng)組織中表達(dá)量遠(yuǎn)高于里氏擬石磺,推測瘤背石磺適應(yīng)陸棲生活的條件下腸道和神經(jīng)組織活躍度降低,組織細(xì)胞更新速率比里氏擬石磺慢。Pr-14-3-3在里氏擬石磺的背部和腹足組織表達(dá)量高于瘤背石磺,推測里氏擬石磺背部組織的細(xì)胞不斷增殖分化,且細(xì)胞凋亡信號受到抑制,以保證在角質(zhì)膜頻繁更換的同時不斷有新的細(xì)胞補充。瘤背石磺和里氏擬石磺在長期的系統(tǒng)進化過程中各自形成了背部皮膚對環(huán)境的適應(yīng),本研究對兩種石磺背部皮膚的差異蛋白和兩棲適應(yīng)性有了更深入的了解,為全面分析兩個近緣物種的環(huán)境適應(yīng)性提供了蛋白組學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及部分候選蛋白,為深入研究石磺科貝類的趨異進化提供了有力參考。
【圖文】：

圖 2-1 兩種石磺活體背面觀和腹面觀Fig. 2-1 Dorsal view and ventral view of Onchidium struma and Paraoncidium reevesi1. 瘤背石磺 （Onchidium struma） 2. 里氏擬石磺 （Paraoncidium reevesii）2016 年 7 月，采集成體瘤背石磺和里氏擬石磺（廣東湛江），在實驗室養(yǎng)箱中暫養(yǎng)，，取東海灘涂底泥鋪在箱底，營造石磺適宜生存的環(huán)境，投喂玉米粉，噴灑千分之五的人工海水，保持養(yǎng)殖箱中的濕度。表 2-1 兩種石磺實驗樣品信息（n=3）Tab. 2-1 Specimens information of Onchidium struma and Paraoncidium reevesii

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文參照TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit（南京諾唯贊公司）產(chǎn)品說明書，需要注意的是Proteinase K溶液孵育時，室溫下25 min；滴加1 ×Equilibration Buffer孵育樣本時，室溫30 min；使用DAPI在暗環(huán)境中染色，結(jié)束后立即在熒光顯微鏡下檢測拍照。1.2.3 組織觀察用電光學(xué)顯微鏡 Nikon Eclipse Ni 觀察 HE 染色組織切片。TUNEL染色組織切片置于尼康 55i 熒光顯微鏡下觀察。2 結(jié)果與分析2.1 HE 染色組織切片觀察
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2590690