【摘要】：背景:組蛋白賴氨酸的甲基化在基因表達(dá)、染色質(zhì)重塑和細(xì)胞分化中具有重要的調(diào)控作用,組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(KMTs)和組蛋白賴氨酸去甲基化酶(KDMs)能動(dòng)態(tài)調(diào)控這一過程。LSD1是第一個(gè)被鑒定出的組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶,已知它能催化H3K4和H3K9位點(diǎn)的單甲基化和雙甲基化的去除,從而抑制或激活基因的轉(zhuǎn)錄。PRC2復(fù)合物中的主要成分EZH2是H3K27的甲基轉(zhuǎn)移酶,可通過對(duì)H3K27進(jìn)行甲基化修飾來抑制基因的轉(zhuǎn)錄。目的:除了已知的H3K4、H3K9位點(diǎn),我們系統(tǒng)性的探究在MCF-7中LSD1沉默還能夠影響哪些組蛋白賴氨酸位點(diǎn)的甲基化水平;并通過已知的LSD1靶基因探究LSD1是否通過影響其靶基因啟動(dòng)子處組蛋白賴氨酸的甲基化水平,來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄;進(jìn)一步明確LSD1對(duì)靶基因的調(diào)控是否是與其他轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用,共同調(diào)控的結(jié)果。方法:我們?cè)贛CF-7中對(duì)LSD1進(jìn)行沉默,通過質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)探究LSD1能夠影響組蛋白賴氨酸甲基化水平的位點(diǎn);通過Western blot、RT-PCR和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析LSD1對(duì)靶基因的調(diào)控,以及靶基因啟動(dòng)子處組蛋白甲基化水平的變化;通過免疫共沉淀IP、免疫熒光IF和GST-pull down實(shí)驗(yàn)鑒定LSD1和EZH2之間的相互作用及作用結(jié)構(gòu)域;通過對(duì)LSD1、EZH2沉默后的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并利用STING、GO等方法對(duì)檢測(cè)到的兩者共同影響的蛋白進(jìn)行比較分析,得出兩者共同影響的信號(hào)通路;通過ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EZH2沉默前后LSD1在信號(hào)通路中關(guān)鍵基因啟動(dòng)子上的結(jié)合情況。結(jié)果:在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中,LSD1除了能調(diào)控已知的H3K4和H3K9位點(diǎn)的甲基化水平,還能影響H3K27、H3K36、H3K79位點(diǎn)的甲基化水平;甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2能與去甲基化酶LSD1相互作用,共同靶向干擾素信號(hào)通路基因,共同抑制干擾素刺激基因(如IRF9)的表達(dá)。結(jié)論:在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中,LSD1廣泛影響組蛋白賴氨酸的甲基化水平,并且能與其他甲基轉(zhuǎn)移酶形成一個(gè)新系統(tǒng),共同調(diào)控組蛋白賴氨酸甲基化水平,從而調(diào)控如干擾素刺激基因(IRF9)等基因的表達(dá)。
【圖文】：

包括 PRC1 和 PRC2 兩個(gè)復(fù)合物。PRCl 復(fù)態(tài),PRC2 復(fù)合物主要是在起始階段就抑制過維持 H3K27 的雙甲基化和三甲基化進(jìn)行化酶、組蛋白去甲基化酶、DNA 甲基轉(zhuǎn)移控基因的轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)的重塑[29-31]。最近研抑制PRC2結(jié)合到H3上，這說明H3K4的去重要的[32]。C2 復(fù)合體中有一亞基成分，稱為 EZH2，它H2 中包含一個(gè)活性催化結(jié)構(gòu)域 SET 區(qū)域飾，使 EZH2 具有甲基轉(zhuǎn)移酶的活性[33]。但亞基 EED 和 SUZ12 形成復(fù)合物（PRC2）（圖 1.2）。另外，EZH2 還能直接與 DNA。

干擾素基因均可表達(dá)。表達(dá)的干擾素在機(jī)體中通過一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，合成功能性蛋白質(zhì)、酶等，，從而發(fā)揮其抗病毒及免疫調(diào)節(jié)的功能[35]。1.5.2 Ⅰ型干擾素信號(hào)通路——JAK-STAT 信號(hào)傳導(dǎo)通路Ⅰ型干擾素結(jié)合到細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體，使得受體兩亞基異二聚化，然后與細(xì)胞質(zhì)中的酪氨酸激酶（JAK 激酶）結(jié)合，干擾素受體胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸被磷酸化。受體磷酸化后又增強(qiáng)了受體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化蛋白（STAT）的相互作用，繼而磷酸化并活化了 STAT 家族成員（STATs）[37]。磷酸化的 STATs 離開受體，STAT1 和 STAT2 形成異源二聚體，招募干擾素調(diào)節(jié)因子 9（IRF9）并與之相互作用形成干擾素刺激基因因子 3（ISGF3），隨后在 IRF9 的指引下進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到干擾素誘導(dǎo)基因（ISGs）啟動(dòng)子的刺激應(yīng)答元件（ISRE）上，誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄[38]（圖 1.3）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9

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