【摘要】：背景:骨質(zhì)疏松(Osteoporosis,OP)是指全身骨質(zhì)量和骨密度減少以及骨組織微結(jié)構(gòu)退變,進(jìn)而導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低,骨脆性增加,并伴隨著病理性骨折的發(fā)生。OP隨年齡的增長(zhǎng)變得越來越普遍,在墨西哥50歲以上的人群約45%患有OP,且女性比男性更常見,比率高達(dá)9%-38%。據(jù)統(tǒng)計(jì)歐盟約有2200萬婦女和550萬男子患有OP,且白人和亞洲人患病幾率更高,此外由OP導(dǎo)致的骨折發(fā)病率已超過心肌梗死、中風(fēng)等疾病,極大地危害人們健康。美國(guó)第3次全國(guó)營(yíng)養(yǎng)與健康調(diào)查,全國(guó)50歲以上男女骨質(zhì)疏松患病率分別是3%-6%和13%-18%。我國(guó)作為一個(gè)進(jìn)入老齡化階段的人口大國(guó),在未來一段時(shí)間內(nèi)骨質(zhì)疏松的患病人數(shù)會(huì)逐年不斷增加。OP的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,目前尚沒有完全研究清楚。涉及到骨重塑功能障礙、抑制性免疫調(diào)節(jié)紊亂、骨分化抑制以及維生素D缺乏、激素調(diào)節(jié)等多種因素。目前已知研究的是在骨重塑的生理過程中,骨吸收和骨形成平衡是由成骨細(xì)胞(Osteoblast)和破骨細(xì)胞(Osteoclast)維持的,成骨細(xì)胞移動(dòng)到吸收部位通過分泌骨基質(zhì),骨基質(zhì)礦化而形成新骨。破骨細(xì)胞可在多位點(diǎn)對(duì)骨基質(zhì)進(jìn)行吸收和降解作用,而成骨細(xì)胞則會(huì)在骨吸收區(qū)分化形成新的骨組織,而OP的發(fā)生正是由于骨吸收大于骨形成,骨平衡被打破導(dǎo)致的。但是骨形成和骨吸收過程中的具體分子信號(hào)傳導(dǎo)通路、參與基因、調(diào)控方式等生物學(xué)機(jī)制尚無明確答案。已知的研究表明在正常骨骼中,骨基質(zhì)重塑是恒定的,該過程由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞組成的骨代謝單元(BMUs)維持。但在OP模型中,破骨細(xì)胞降解骨骼基質(zhì)的速度快于成骨細(xì)胞重建骨骼,從而使骨量丟失加快,新骨形成減慢,骨密度降低。在骨重建過程中,BMUs分泌的細(xì)胞因子作用顯著,其中破骨細(xì)胞分泌的OPG/OCIF可抑制成骨細(xì)胞傳導(dǎo)通路和破骨細(xì)胞生成;TGF-β可促進(jìn)骨髓成骨細(xì)胞祖細(xì)胞增殖,使成骨細(xì)胞數(shù)量增多;IGF-1可刺激成骨細(xì)胞增殖分化,增加骨鈣素產(chǎn)生等。此外,激素在骨重建及骨吸收過程中也扮演著重要的角色,研究表明缺乏雌激素可增加骨吸收,以及減少新骨沉積。雌激素與雌激素受體(ER)結(jié)合在骨轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要的作用。雌激素與ER結(jié)合可刺激成骨細(xì)胞分化,增加骨基質(zhì)沉積;破骨細(xì)胞前體中ERα高表達(dá),但在成熟破骨細(xì)胞中卻不表達(dá);另外雌激素可通過調(diào)節(jié)c-Jun表達(dá)及其N端激酶磷酸化抑制骨吸收,此外,甲狀旁腺激素(PTH)及鈣降素可通過調(diào)節(jié)骨鈣代謝在骨轉(zhuǎn)換及骨質(zhì)沉積中起重要作用。近年來有研究表明基因多態(tài)性也與OP有關(guān),可決定OP的遺傳傾向,并影響雌激素治療OP。OP的發(fā)生是由多因素參與和影響的非常復(fù)雜的過程。通過各種信號(hào)通路及其下游靶基因調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖以及凋亡,導(dǎo)致骨量減少,引發(fā)骨折。其中NF-κ B信號(hào)通路與OP病理過程緊密相關(guān)。研究表明p50/p52基因敲除的小鼠中破骨細(xì)胞生成受到抑制;且成骨細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子可促進(jìn)其細(xì)胞內(nèi)NF-κ B的活化。此外,雙敲除NF-κ B1和NF-κ B2的小鼠模型中破骨細(xì)胞分化受到抑制。NF-κB通路下游的靶基因,如凋亡因子家族、趨化因子等在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤生成及疾病代謝中發(fā)揮重要的作用。絕經(jīng)后女性雌激素分泌減少,從而與成骨細(xì)胞表面的雌激素受體結(jié)合降低,促進(jìn)細(xì)胞因子釋放,進(jìn)而使NF-κB異�；罨�,影響下游靶基因表達(dá)(如凋亡因子家族、趨化因子、腫瘤壞死因子等),使成骨細(xì)胞增殖分化受到抑制,引發(fā)OP病變。研究表明,雌激素可抑制造血干細(xì)胞以及成骨細(xì)胞等分泌多種細(xì)胞因子,如IL-1、TNF、GM-CSF等,而這些因子可促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化并抑制其發(fā)生凋亡;此外破骨細(xì)胞的活化受多種信號(hào)分子調(diào)節(jié),其中RANKL(NF-κB配體的受體激活劑)研究廣泛,其由成骨細(xì)胞產(chǎn)生,并刺激RANK(NF-κB的受體激活劑),使NF-κB通路以及破骨細(xì)胞的骨吸收能力受到抑制。趨化因子配體12(CXC Ligand 12,CXCL12),即基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1),是NF-κB通路下游相關(guān)的靶基因,其在腦、胸腺及骨髓等組織中均有表達(dá),對(duì)淋巴細(xì)胞和充質(zhì)間干細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化性,且有研究表明CXCL12在炎性骨損壞區(qū)高表達(dá),對(duì)破骨細(xì)胞生成具有抑制作用。Bcl-2蛋白作為Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的代表,其作用機(jī)理是是通過抑制線粒體的通透性的改變來抑制細(xì)胞凋亡的,與之相關(guān)的主要包括抑制氧化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子的跨膜運(yùn)動(dòng)和形成離子通道抑制細(xì)胞凋亡。到目前為止,國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于NF-κB信號(hào)通路對(duì)骨質(zhì)疏松的影響的研究較少,NF-κB信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用機(jī)制尚不明確。因此,研究NF-κ B信號(hào)通路與骨平衡機(jī)制的關(guān)系對(duì)破解骨質(zhì)疏松這個(gè)世界性難題具有極其重要的意義。由此,我們得到啟發(fā),Bcl-2、CXCL12能否成為影響骨質(zhì)疏松的目標(biāo)基因?調(diào)控NF-κB信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞有何影響?能否通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路及其下游的Bcl-2、CXCL12基因的表達(dá)來研究骨質(zhì)疏松發(fā)病的新機(jī)制?為預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥探索新靶點(diǎn)和新方法。第一章:骨質(zhì)疏松患者細(xì)胞增殖、凋亡及成骨能力檢測(cè)研究目的:本研究中對(duì)骨質(zhì)疏松(Osteoporosis,OP)組患者和對(duì)照組(正常和低骨量組,也即非骨質(zhì)疏松組)患者行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)取下的股骨頸組織進(jìn)行成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分離培養(yǎng),對(duì)比研究?jī)山M患者成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖和凋亡狀況、成骨細(xì)胞成骨能力。并為第二章的實(shí)驗(yàn)提供傳代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。研究方法:收集2015年3月至2016年7月我院骨科住院的需進(jìn)行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的絕經(jīng)期女性患者60例,平均年齡62±7.83歲,并根據(jù)雙能X線骨密度檢查結(jié)果分為骨質(zhì)疏松組(OP,n=32,平均年齡64±6.78歲)和對(duì)照組(正常和低骨量組CK,n=28,平均年齡61±8.53歲),對(duì)不同意研究、繼發(fā)性O(shè)P以及近幾月服用過影響骨代謝藥物的患者予以病例排除。所有受試患者及其家人均得到告知且簽署研究同意書,并符合倫理道理標(biāo)準(zhǔn),組間年齡差距無顯著性差異(P0.05);術(shù)后將松質(zhì)股骨頸取下,并采用Robey PG等人報(bào)道的方法進(jìn)行成骨細(xì)胞分離培養(yǎng),以及參照Machonal等人報(bào)道的方法進(jìn)行破骨細(xì)胞的分離培養(yǎng);并對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)。對(duì)各組傳代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞每隔12h進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)與分析,利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490nm處檢測(cè)各組細(xì)胞吸光值,數(shù)據(jù)以相比于對(duì)照組中平均活細(xì)胞比例表示細(xì)胞的增殖情況檢測(cè)。細(xì)胞凋亡分析是在傳代培養(yǎng)后的48h,參照試劑盒操作,對(duì)成骨、破骨細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC/PI雙染色,于BDFACSCalibur流式細(xì)胞分析儀上分析早、晚期細(xì)胞凋亡率;對(duì)兩組成骨細(xì)胞進(jìn)行成骨誘惑,并于第7d和14d對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素含量檢測(cè);持續(xù)誘導(dǎo)21天后使用茜素紅對(duì)成骨細(xì)胞的礦化程度進(jìn)行檢測(cè)。Real-time RT-PCR檢測(cè)CK組和OP組成骨細(xì)胞誘導(dǎo)7天后ALP基因的表達(dá)情況。結(jié)果:兩組成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞誘導(dǎo)成功。1、利用MTTL比色法檢測(cè)兩組成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果顯示OP組與CK組相比,成骨細(xì)胞增殖隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)顯著受到抑制,破骨細(xì)胞增殖則顯著增強(qiáng)。2、AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示與CK組相比,OP組成骨細(xì)胞早晚期細(xì)胞凋亡比率顯著升高,破骨細(xì)胞早晚期細(xì)胞凋亡比率顯著降低。3、對(duì)CK組和OP組原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo),在第7天和14天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行ALP活性和骨鈣素含量檢測(cè),ALP活性檢測(cè)的結(jié)果顯示OP組成骨細(xì)胞的ALP活性明顯低于CK組,成骨誘惑第7天,骨質(zhì)疏松組成骨細(xì)胞ALP活性比對(duì)照組低34%,第14天,ALP活性比對(duì)照組低36%,(P0.05),對(duì)照組的ALP的表達(dá)明顯高于OP組。骨鈣素含量檢測(cè)結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松組成骨細(xì)胞的骨鈣素含量明顯低于對(duì)照組,成骨誘惑第7天,骨質(zhì)疏松組成骨細(xì)胞骨鈣素含量比對(duì)照組低2.5 ng/u g,第14天鈣離子濃度比對(duì)照組低5.1 ng/ug,(P0.01)。4、鈣結(jié)節(jié)數(shù)目檢測(cè)結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松組成骨細(xì)胞中鈣結(jié)節(jié)數(shù)目明顯低于對(duì)照組。5、CK組和OP組成骨細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行ALP的基因表達(dá)檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示,CK組的ALP的基因表達(dá)明顯高于OP組,(P0.05),其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本實(shí)驗(yàn)說明,對(duì)照組成骨細(xì)胞的成骨能力明顯強(qiáng)于骨質(zhì)疏松組。結(jié)論:通過對(duì)ALP、骨鈣素、鈣結(jié)節(jié)數(shù)量等檢測(cè)指標(biāo)的對(duì)比研究,證實(shí)骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中成骨細(xì)胞的增殖及成骨能力明顯降低;破骨細(xì)胞的增殖能力和活性明顯增強(qiáng)。與對(duì)照組相比,骨質(zhì)疏松組患者總的成骨能力顯著降低。通過對(duì)人體骨質(zhì)疏松模型中提取的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)和增殖,為第二章的實(shí)驗(yàn)提供傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。第二章:骨質(zhì)疏松發(fā)病與Bcl-2、CXCL12及NF-κ B信號(hào)通路的關(guān)系研究目的:研究在NF-κ B信號(hào)通路下干預(yù)Bcl-2和CXCL12基因表達(dá)對(duì)骨質(zhì)疏松的影響規(guī)律,從分子生物學(xué)及信號(hào)通路水平探索骨質(zhì)疏松發(fā)病的新機(jī)制,為OP的預(yù)防及治療探索新機(jī)制和新方法。研究方法:第一章培養(yǎng)的細(xì)胞傳代培養(yǎng)后l0d的成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞中總RNA的提取鑒定,采用熒光定量PCR檢測(cè)兩組成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的內(nèi)Bcl-2、CXCL12及NF-κ B mRNA水平。將傳代培養(yǎng)10d后的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞于細(xì)胞裂解液中裂解,提取蛋白質(zhì),并使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)兩組成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的內(nèi)Bcl-2、CXCL12 及NF-κ B 蛋白水平。將Bcl-2 siRNA,CXCL12 siRNA及NF-κ B siRNA的轉(zhuǎn)染至正常組成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中,RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Bcl-2及CXCL12表達(dá)情況,并檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的作用,對(duì)成骨細(xì)胞中ALP活性和骨鈣素進(jìn)行測(cè)定。購(gòu)買SPF級(jí)正常小鼠24只和Bcl-2基因敲除小鼠24只,測(cè)定其成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的增殖能力,并檢測(cè)其骨鈣素,ALP及NF-κB水平。結(jié)果:對(duì)OP組和CK組的傳代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)Bcl-2和CXCL12 mRNA水平,Bcl-2的檢測(cè)結(jié)果顯示CK組成骨細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)明顯高于OP組,(P0.01);破骨細(xì)胞中的Bcl-2的表達(dá):CK組明顯低于OP組,(P0.01)。CXCL12檢測(cè)結(jié)果顯示成骨細(xì)胞中CXCL12的表達(dá),CK組高于OP組,(P0.05);破骨細(xì)胞中CXCL12表達(dá),CK組明顯低于OP組,(P0.01)。NF-κ B檢測(cè)結(jié)果顯示成骨細(xì)胞中NF-κ B的表達(dá),CK組低于OP組,(P0.05);破骨細(xì)胞中NF-κ B表達(dá),CK組明顯高于OP組,(P0.01)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)兩組細(xì)胞中Bcl-2和CXCL12的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果表明較CK組,OP組成骨細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和CXCL12蛋白水平顯著降低,NF-κB表達(dá)明顯增加;而OP組破骨細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和CXCL12蛋白水平顯著增加,NF-κB表達(dá)明顯降低。Bcl-2 siRNA及CXCL12 siRNA的轉(zhuǎn)染成功。低表達(dá)Bcl-2基因能有效的抑制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的凋亡;低表達(dá)CXCL12有效的促進(jìn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖。低表達(dá)Bcl-2及CXCL12降低了成骨細(xì)胞的ALP活性和骨鈣素含量。低表達(dá)NF-κ B促進(jìn)了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖,抑制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的凋亡(P0.05)。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Bcl-2基因敲除組成小鼠的骨細(xì)胞增殖能力顯著下降,破骨細(xì)胞增殖能力顯著上升(P0.01)。Bcl-2敲除小鼠原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶的活性明顯低于對(duì)照組(P0.05)。成骨誘導(dǎo)第14天,骨質(zhì)疏松組稱骨細(xì)胞ALP活性比對(duì)照組低38%(P0.05)。成骨誘導(dǎo)第7天及第14天,Bcl-2敲除小鼠組成骨細(xì)胞骨鈣素含量比對(duì)照組低,(P0.01)。對(duì)照組成骨細(xì)胞中NF-κB表達(dá)低于Bcl-2敲除組(P0.01);破骨細(xì)胞蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組NF-κ B表達(dá)高于Bcl-2敲除組(P0.01)結(jié)論:Bcl-2和CXCL12基因異常表達(dá)可導(dǎo)致骨形成與骨吸收平衡被打破。選擇性抑制NF-κ B信號(hào)通路可以減少其下游Bcl-2和CXCL12基因的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,抑制破骨細(xì)胞分化進(jìn)而抑制骨吸收。敲除Bcl-2基因可以反向影響NF-κB基因的表達(dá),影響NF-κB信號(hào)通路的活化。Bcl-2和CXCL12表達(dá)水平降低可能是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMO)成骨能力受損和趨化活性降低的關(guān)鍵原因。通過調(diào)節(jié)NF-κ B信號(hào)通路及其下游Bcl-2和CXCL12基因表達(dá)可以調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增值與凋亡。對(duì)NF-κ B信號(hào)通路及其下游靶基因的調(diào)控可以為預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥提供新的研究靶點(diǎn)。
【圖文】：

對(duì)兩組骨組織分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行改良Ｇｏｍｏｒｉ堿性磷酸酶鈣鈷法染色逡逑鑒定細(xì)胞形態(tài)。成骨細(xì)胞被染色呈棕黑色細(xì)微顆粒，而陰性對(duì)照細(xì)胞內(nèi)無棕黑微逡逑粒（圖２．１）。低倍顯微鏡下任選１０個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)１００個(gè)細(xì)胞。對(duì)兩逡逑組細(xì)胞進(jìn)行成骨細(xì)胞純度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了兩組細(xì)胞的純度均在９０％以上，這就說明逡逑本研究中成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)成功，為后期的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。逡逑柋邋＾逡逑｜邋ｆ逡逑圖２．邋１ＡＬＰ染色鑒定成骨細(xì)胞形態(tài)逡逑Ｗ，邋ｉ邋Y"邋１邋彳入￥邋ｖ＇；逡逑圖２．邋２ＴＲＡＰ染色鑒定破骨細(xì)胞形態(tài)逡逑對(duì)兩組骨組織分離培養(yǎng)的破骨細(xì)胞進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（ＴＲＡＰ）觀逡逑察與鑒定破骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)。兩組細(xì)胞在顯微鏡下觀察均發(fā)現(xiàn)ＴＲＡＰ染色的逡逑細(xì)胞，細(xì)胞核陰性染色，呈黃色，核數(shù)可多達(dá)十幾個(gè)，其顏色不均勻，呈典型的逡逑“荷包煎蛋”樣形態(tài)（圖２．２）。這就說明本研究中破骨細(xì)胞分離培養(yǎng)成功，為逡逑后期的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。逡逑３４逡逑

對(duì)兩組骨組織分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行改良Ｇｏｍｏｒｉ堿性磷酸酶鈣鈷法染色逡逑鑒定細(xì)胞形態(tài)。成骨細(xì)胞被染色呈棕黑色細(xì)微顆粒，，而陰性對(duì)照細(xì)胞內(nèi)無棕黑微逡逑粒（圖２．１）。低倍顯微鏡下任選１０個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)１００個(gè)細(xì)胞。對(duì)兩逡逑組細(xì)胞進(jìn)行成骨細(xì)胞純度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了兩組細(xì)胞的純度均在９０％以上，這就說明逡逑本研究中成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)成功，為后期的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。逡逑柋邋＾逡逑｜邋ｆ逡逑圖２．邋１ＡＬＰ染色鑒定成骨細(xì)胞形態(tài)逡逑Ｗ，邋ｉ邋Y"邋１邋彳入￥邋ｖ＇；逡逑圖２．邋２ＴＲＡＰ染色鑒定破骨細(xì)胞形態(tài)逡逑對(duì)兩組骨組織分離培養(yǎng)的破骨細(xì)胞進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（ＴＲＡＰ）觀逡逑察與鑒定破骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)。兩組細(xì)胞在顯微鏡下觀察均發(fā)現(xiàn)ＴＲＡＰ染色的逡逑細(xì)胞，細(xì)胞核陰性染色，呈黃色，核數(shù)可多達(dá)十幾個(gè)，其顏色不均勻，呈典型的逡逑“荷包煎蛋”樣形態(tài)（圖２．２）。這就說明本研究中破骨細(xì)胞分離培養(yǎng)成功，為逡逑后期的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。逡逑３４逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R580

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2587723