【摘要】：抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是兩棲類、哺乳動(dòng)物、魚類等生物非特異性免疫防御系統(tǒng)的主要成分之一,具有廣譜殺菌、抑制病毒、抑殺腫瘤細(xì)胞等作用。鱟素是一種宿主防御肽,具有很強(qiáng)的抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了鱟素(Tachyplesin I)的組成型酵母表達(dá)菌株,并使用7.5L發(fā)酵罐成功表達(dá)出了高活性的基因工程鱟素。另外,對(duì)其體內(nèi)外抗金黃色葡萄球菌活性進(jìn)行了研究,并從是否能夠調(diào)動(dòng)機(jī)體的天然免疫功能等角度探討了其與宿主同源肽之間的相互關(guān)系。本研究為了解決基因工程鱟素工業(yè)化生產(chǎn)問題,使用本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的酵母表達(dá)系統(tǒng),對(duì)基因工程鱟素Tachyplesin I(TP I)進(jìn)行工業(yè)化(150L)生產(chǎn),并在此基礎(chǔ)上對(duì)其皮膚抗菌凝膠進(jìn)行研制。根據(jù)本研究要求,設(shè)計(jì)并安裝了發(fā)酵設(shè)備、控制設(shè)備、輔助設(shè)備等。發(fā)酵設(shè)備采用15L-50L-150L三個(gè)發(fā)酵罐,兩兩相連;控制設(shè)備采用自動(dòng)控制工作臺(tái),監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程相關(guān)參數(shù);輔助設(shè)備包括空氣壓縮機(jī)、蒸汽發(fā)生機(jī)、冷凍水循環(huán)機(jī)等。對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行了摸索和優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了基因工程鱟素的工業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)酵過程使用普通高壓空氣,不通入純氧;15L發(fā)酵罐為種子發(fā)酵罐,種子培養(yǎng)基使用YPD培養(yǎng)基,培養(yǎng)基填充量為7L,接種量為1:40,發(fā)酵時(shí)間為14h,轉(zhuǎn)速200rpm/min,通氣量為0.2m3/h;50L、150L發(fā)酵罐為誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)酵罐,種子培養(yǎng)基使用改良BSM培養(yǎng)基,填充比例為60%,接種量為1:20,發(fā)酵時(shí)間為62h,轉(zhuǎn)速分別為240rpm/min、160rpm/min,通氣量分別為1.2m3/h、3.6m3/h;甲醇補(bǔ)料方式采用恒速流加甲醇,流速控制在2m L/L/h;溫度控制在29℃;發(fā)酵過程中不補(bǔ)加酸液、堿液。以金黃色葡萄球菌ATCC25923為指示菌,采用抑菌圈法檢測(cè)其抑菌活性,抑菌圈超過26mm。通過高溫、鈷-60輻照滅菌后,其抑菌活性無明顯下降,證明基因工程鱟素有作為外用藥物制劑原料使用的潛力。進(jìn)行了基因工程鱟素的皮膚抗菌凝膠的研制。使用上述發(fā)酵上清作為抑菌劑,配合中藥提取物和其它輔料,制得抗菌肽凝膠。檢測(cè)其抗菌活性,其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、痤瘡丙酸桿菌、鏈球菌、白色念珠菌等常見皮膚感染菌均有抗菌活性。進(jìn)行溶血試驗(yàn),該凝膠無溶血性和凝血性。對(duì)凝膠進(jìn)行藥物加速試驗(yàn),在6個(gè)月的藥物加速試驗(yàn)過程中,在第1、2、3、6個(gè)月取樣檢測(cè),凝膠性狀無可見變化,無沉淀和分層現(xiàn)象產(chǎn)生,p H值維持在5.5~6,粘度維持在5~5.5Pa.s,抑菌活性無明顯下降,證明其可以通過6個(gè)月的藥物加速試驗(yàn)。為了驗(yàn)證該凝膠的治療效果,使用該凝膠治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(USA300菌株)感染的小鼠。結(jié)果表明,該凝膠具有加快創(chuàng)面愈合的功效,在治療的第1天就使創(chuàng)面無滲出物產(chǎn)生,第2天開始出現(xiàn)結(jié)痂,其脫痂速度也是幾組中最快的,這為抗菌肽作為外用藥原料提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TQ427.26;TQ460.1

【相似文獻(xiàn)】

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1 曹原;基因工程鱟素Tachyplesin I的工業(yè)化生產(chǎn)及其皮膚抗菌凝膠的研制[D];吉林大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：2586798