發(fā)布時(shí)間：2020-03-12 20:47

【摘要】：棉花是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)作物,在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中具有重要作用。棉花纖維是重要的天然纖維來(lái)源。棉纖維細(xì)胞是由胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)快速突起和急速伸長(zhǎng)而形成的單細(xì)胞,具有極度伸長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)。其生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)歷了起始期、快速伸長(zhǎng)期、成熟期和脫水期,是研究植物細(xì)胞發(fā)育的理想材料。同時(shí),纖維細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程也是棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的形成過(guò)程,研究纖維細(xì)胞的發(fā)育及其調(diào)控機(jī)理是解析棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)(長(zhǎng)度和細(xì)度等)形成機(jī)理的重要環(huán)節(jié),將為進(jìn)一步培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)棉花提供理論基礎(chǔ)。近年來(lái)對(duì)棉花纖維發(fā)育的研究取得了一定進(jìn)展,但目前調(diào)控棉纖維發(fā)育的分子機(jī)制仍不清楚。鞘脂(sphingolipids)是含有長(zhǎng)鏈鞘樣堿基骨架的一類(lèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的脂類(lèi)分子,種類(lèi)繁多,廣泛存在于生物膜結(jié)構(gòu)中。鞘脂及其衍生物是許多細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)程中重要的動(dòng)力調(diào)節(jié)器,參與了許多重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,不同種類(lèi)的鞘脂存在于不同組織中,甚至是不同組織的不同細(xì)胞類(lèi)型中,目前對(duì)植物中鞘脂的研究甚少。在棉纖維細(xì)胞極性伸長(zhǎng)過(guò)程中,生物膜系統(tǒng)的面積極度擴(kuò)張,務(wù)必需要不同鞘脂分子的相應(yīng)增加,以滿(mǎn)足各種生理生化活動(dòng)所需,從而協(xié)調(diào)完成伸長(zhǎng)過(guò)程。因此鞘脂的正常合成在纖維細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中可能發(fā)揮了重要作用。為了研究鞘脂在棉花纖維細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中的作用,首先克隆了棉花中3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因的同源基因Gh KDSR2s,然后構(gòu)建反義表達(dá)載體并進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化,探索了下調(diào)Gh KDSR2-1對(duì)棉花植株和纖維生長(zhǎng)發(fā)育的影響,主要結(jié)果如下:1.Gh KDSR2s基因的克隆和序列分析以陸地棉徐州142野生型10dpa的纖維c DNA為模板,擴(kuò)增得到2個(gè)同源的Gh KDSR2基因。其中克隆到的Gh KDSR2-1的c DNA序列包含一個(gè)996bp的ORF,推導(dǎo)的ORF編碼331個(gè)氨基酸殘基,分子量36.0k D,IP=8.065�？寺〉降腉h KDSR2-2的c DNA序列包含一個(gè)999bp的ORF,推導(dǎo)的ORF編碼332個(gè)氨基酸殘基,分子量36.2k D,IP=7.436。Gh KDSR2與擬南芥、可可、蓖麻等物種的3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因具有較高的同源性。這些分析結(jié)果說(shuō)明我們克隆得到的序列是棉花3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因的同源基因。2.Gh KDSR2-1基因的表達(dá)特性為了明確克隆得到的兩個(gè)Gh KDSR2基因表達(dá)特性,利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR分別檢測(cè)了其在野生型棉花的不同組織器官、纖維和胚珠不同發(fā)育時(shí)期,以及纖維突變體的幾個(gè)重要時(shí)期的表達(dá)水平。結(jié)果表明,Gh KDSR2在檢測(cè)樣品中均有表達(dá),但其表達(dá)水平存在明顯差異。在纖維發(fā)育過(guò)程中其表達(dá)峰值出現(xiàn)在快速伸長(zhǎng)期,說(shuō)明Gh KDSR2基因與纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)有一定關(guān)系;進(jìn)一步檢測(cè)了該基因在纖維發(fā)育突變體中的表達(dá)差異,結(jié)果表明在徐州142無(wú)絨無(wú)絮突變體的纖維起始期和超短纖維突變體的纖維快速伸長(zhǎng)期,Gh KDSR2的表達(dá)相較于野生型都有明顯下降,說(shuō)明Gh KDSR2在纖維的起始和伸長(zhǎng)階段可能發(fā)揮了重要作用。3.反義抑制Gh KDSR2-1對(duì)棉花植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響利用Gh KDSR2序列構(gòu)建反義抑制植物表達(dá)載體,并進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)GUS組織化學(xué)染色和PCR擴(kuò)增鑒定獲得7個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花的性狀變異進(jìn)行觀測(cè)和統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示下調(diào)Gh KDSR2導(dǎo)致了植株矮小纖細(xì),生長(zhǎng)緩慢,難以成活;花小,花粉少且嚴(yán)重?cái)∮?因此難以穩(wěn)果;棉桃變小,發(fā)育緩慢,且每個(gè)棉桃中僅有1-2粒種子發(fā)育成熟;葉片變小、顏色變深且表面粗糙。隨后進(jìn)一步對(duì)葉片中葉綠素和木質(zhì)素含量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其葉綠素和木質(zhì)素含量升高,木質(zhì)素分布區(qū)域增多。結(jié)果表明,抑制Gh KDSR2-1表達(dá),棉花植株生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重干擾。4.反義抑制Gh KDSR2-1對(duì)棉花纖維細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響為了明確Gh KDSR2-1對(duì)棉花纖維細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響,首先采用棉花胚珠離體培養(yǎng)方法,檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Gh KDSR2-1的表達(dá)明顯抑制纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng),此結(jié)果與FB2(鞘脂合成抑制劑)處理野生型纖維的結(jié)果一致,說(shuō)明植物鞘脂的正常合成在纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)中具有重要作用。轉(zhuǎn)基因成熟纖維的測(cè)量結(jié)果表明,抑制Gh KDSR2-1的轉(zhuǎn)基因纖維長(zhǎng)度明顯降低,與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)基因纖維長(zhǎng)度降低了18.4%。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明Gh KDSR2基因在纖維伸長(zhǎng)中有著重要作用。掃描電鏡觀察的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因纖維細(xì)胞的起始受到抑制,起始數(shù)量明顯減少。這些結(jié)果證明下調(diào)Gh KDSR2-1抑制了纖維了起始和伸長(zhǎng),說(shuō)明Gh KDSR2在纖維起始和伸長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。5.下調(diào)Gh KDSR2-1抑制棉花種子中脂類(lèi)合成,提高蛋白質(zhì)含量反義抑制Gh KDSR2-1棉花種子中脂類(lèi)含量較野生型降低了2.6%左右,其中C18-0變化最為明顯,下降了約9.2%,而其蛋白含量較野生型升高了13.7%左右,說(shuō)明下調(diào)Gh KDSR2-1抑制棉花種子中脂類(lèi)合成,提高蛋白質(zhì)含量。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S562

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1 唐英才;下調(diào)棉花3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因（GhKDSR2-1）的表達(dá)對(duì)棉纖維發(fā)育的影響[D];西南大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：2586620