【摘要】：許多雙殼類貝類有兩種線粒體遺傳方式,一種通過精子傳遞線粒體基因組,一種通過卵子傳遞線粒體基因組。這種現(xiàn)象被稱為線粒體基因組的雙單親遺傳(doubly uniparental inheritance,DUI)。存在DUI現(xiàn)象的物種中,存在著兩種異質(zhì)性的線粒體DNA(mtDNA),被稱為F型(F-type)和M型(M-type)mtDNA,F-type mtDNA隨雌性親本傳遞給雌雄后代,M-type mtDNA隨雄性親本傳遞給雄性后代。并且F、M-type mtDNA有很大的差異,單基因COII和ATP8的差異性較大。本實(shí)驗(yàn)首先對三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)F、M-type ATP8基因進(jìn)行了克隆,得到了他們的cDNA全序列。在此基礎(chǔ)上研究了三角帆蚌從胚胎時期到三齡成熟時期時F、M-type ATP8基因的表達(dá)差異,并對本實(shí)驗(yàn)室前期F、M-type COII基因在早期三角帆蚌中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。同時通過對F-type ATP8基因在雌雄群體間的SNPs的關(guān)聯(lián)性分析來建立有效區(qū)分三角帆蚌雌雄性別的分子標(biāo)記。具體的研究內(nèi)容如下:1.三角帆蚌F、M-type ATP8基因的克隆和結(jié)構(gòu)分析首次獲得了三角帆蚌F、M-type ATP8基因的cDNA全序列,其中F-type ATP8基因全長275bp,包含5’端非翻譯區(qū)54bp,3’端非翻譯區(qū)71bp,ORF區(qū)共150bp,編碼49個氨基酸,所編碼的氨基酸整體表現(xiàn)為疏水性。M-type ATP8基因全長222bp;5’端無UTR;3端非翻譯區(qū)45bp;ORF區(qū)共177bp,編碼58個氨基酸,所編碼的氨基酸整體表現(xiàn)為疏水性。他們的不穩(wěn)定系數(shù)分別為46.90和56.34,表明他們所編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定。同源性分析發(fā)現(xiàn),F-type ATP8基因與池蝶蚌的相似性最高,其次是與其他的淡水蚌類具有一定的相似性;而M-type ATP8基因相則與淡水蚌類的相似性不是太高,說明了相對于F-type ATP8基因,M-type ATP8基因在進(jìn)化的過程中保守性較差。2.三角帆蚌F、M型COII基因和ATP8基因的表達(dá)熒光定量檢測各時期各組織中M、F-type COII基因的表達(dá)。結(jié)果表明早期幼齡(胚胎期-5月齡)三角帆蚌的組織團(tuán)中,M、F-type COII基因均能檢測出,且同時期中F-type COII基因的表達(dá)量顯著高于M-type COII;六月齡各組織中,M-type COII基因在性腺中表達(dá)量最高,相同組織中F-type COII基因的表達(dá)量仍處于較高水平。胚胎期到8月齡的三角帆蚌性腺部位組織團(tuán)中,M、F-type ATP8基因在各時期均有表達(dá),同時期對比發(fā)現(xiàn),F-type ATP8基因的表達(dá)量明顯高于M-type ATP8基因。一齡H.cumingii中,M、F-type ATP8基因在雌雄蚌的各組織中均能檢測到,雌雄對比發(fā)現(xiàn)F-type ATP8表達(dá)豐度高于M-type ATP8,證實(shí)了F-type ATP8基因的主導(dǎo)地位。二齡H.cumingii中,F-type ATP8基因在雌雄各組織中均能檢測到表達(dá);M-type ATP8基因在雌雄各組織中僅在性腺中高表達(dá),其余各組織中均是微量表達(dá)或不表達(dá)。在三齡三角帆蚌中,F-type ATP8基因在雌雄各組織中均能檢測到,M-type ATP8基因在雌性各組織中的表達(dá)豐度都非常低,而在雄性各組織中,僅在性腺中高表達(dá),其余組織中幾乎檢測不到。3.三角帆蚌F-type ATP8基因SNP位點(diǎn)篩選及雌雄群體差異性分析F-type ATP8基因DNA序列中檢測到16個SNP位點(diǎn),單核苷酸多態(tài)性比較豐富。對雄性和雌性群體中的SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn),只有少數(shù)被檢測到的SNP位點(diǎn)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在M和F群體中基因型計(jì)學(xué)差異的有9個SNP,基因型和等位基因頻率都存在差異的有4個SNP。外顯子區(qū)域,E-33A-G,E-36T-G,E-40T-A,E-42T-A,E-109G-A,E-126A-G,E-150A-G,E-169G-A,E-182C-T位點(diǎn)基因型都存在極顯著性差異(P0.01);E-64A-T,E-84A-G,E-87A-G,E-114T-C位點(diǎn)基因型存在顯著性差異(P0.01),等位基因頻率存在顯著性差異(0.01P0.05)。其中,E-115-G位點(diǎn)的G/A基因型特異性存在于雌性群體中,在雄性群體中全部為G/G基因型。4.三角帆蚌精子存活率的研究利用曙紅Y染色劑只能對死亡后的精子著色的原理對三角帆蚌精子存活率進(jìn)行了研究,首先我們篩選出了曙紅Y的最佳染色濃度為0.05%和最適染色時間為10min。三角帆蚌精子的存活率與溫度成負(fù)相關(guān)的關(guān)系,既溫度越高,死亡率越高,這一方面可能是因?yàn)闇囟壬邥䦟颖旧碓斐梢欢ǖ膿p傷導(dǎo)致死亡,另一方面可能是溫度升高會增加精子被激活的數(shù)量,進(jìn)而導(dǎo)致死亡率的上升。三角帆蚌精子的存活率還與水體中的離子濃度和種類有關(guān),生理鹽水中的死亡率略高于蒸餾水中,這可能與生理鹽水中含有一定的Cl-有一定的關(guān)系。而在河道水系中,死亡率遠(yuǎn)高于其他水體環(huán)境中的死亡率,這說明了離子含量越高,死亡率也越高。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2581051