【摘要】：乳酸菌可以與腸道粘膜免疫系統(tǒng)相互作用,在抑制腸道致病菌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、維持腸道微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用。而乳酸菌發(fā)揮益生作用的前提是其與腸上皮細(xì)胞的粘附,粘附作用是菌株定植腸道的第一步。乳酸菌對腸道上皮細(xì)胞的粘附作用有助于其在腸道定植、增強(qiáng)乳酸菌與腸道細(xì)胞之間的交流、抑制病原菌在腸道的定植和提高機(jī)體免疫力。因而乳酸菌的粘附性是評價其作為益生菌的重要指標(biāo)。最新研究發(fā)現(xiàn),在乳酸乳球菌中,細(xì)胞外膜的絲氨酸蛋白酶lactocepin除了有水解蛋白質(zhì)、抗炎等功能外,還能介導(dǎo)乳酸菌的粘附作用,主要是通過影響范德華力的改變。為了研究lactocepin是否介導(dǎo)乳酸菌的粘附,本文以副干酪乳桿菌為載體,用λ-Red重組系統(tǒng)敲除lactocepin的編碼基因prtP,構(gòu)建副干酪乳桿菌1 actocepin缺失突變株。并比較了突變株與親本株在生物學(xué)特性、體內(nèi)外粘附性以及對腸道免疫影響等的差異。主要的結(jié)果如下:比較副干酪乳桿菌親本株與lactocepin缺失突變株菌的生長曲線、表面疏水性、自凝聚能力、抑制致病菌的能力及藥敏性。結(jié)果表明,lactocepin缺失,副干酪乳桿菌生長速度減慢,疏水性和自凝聚能力顯著下降,抑菌能力無明顯變化,對不同抗生素的敏感性有所改變。副干酪乳桿菌親本株對諾氟沙星、環(huán)丙沙星、多粘菌素B、鏈霉素均具有耐藥性;對四環(huán)素和青霉素G中度敏感;對利福平、頭孢唑林和頭孢拉定均敏感,而lactocepin缺失突變株菌突變株對諾氟沙星、多粘菌素B和鏈霉素均有耐藥性;對環(huán)丙沙星、青霉素G和頭孢拉定中度敏感;對利福平、四環(huán)素、頭孢唑林均敏感。本研究還測定了副干酪乳桿菌親本株與lactocepin缺失突變株對小鼠巨噬細(xì)胞、脾臟細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞以及腸黏液的粘附能力,建立了四種體外粘附模型。實驗采取了鏡檢法、涂板法測乳酸菌對細(xì)胞的粘附性,熒光標(biāo)記法測乳酸菌的體內(nèi)粘附數(shù)。結(jié)果顯示,lactocepin影響乳酸菌對不同細(xì)胞粘附性。在巨噬細(xì)胞上,親本株粘附的數(shù)量為27.7±2.52個,lactocepin缺失突變株粘附的數(shù)量是19.3±3.06個,明顯高于脾臟細(xì)胞的19.3±2.08個、10.7±1.53個和小腸上皮細(xì)胞的14.7±1.53個、8.3±1.53個,且親本株對三種細(xì)胞的粘附量均顯著高于突變株。親本株對小鼠小腸黏液的粘附率為20.07±0.18%,突變株的粘附率為16.96±0.82%,親本株顯著高于突變株(P0.01)。本試驗采用流式細(xì)胞儀分析了兩株受試乳酸菌在小鼠腸道中的定植與分布。結(jié)果表明,親本株與突變株在腸道中的定植情況不相同。突變株在腸道的定植主要發(fā)生在灌胃前期,回腸和結(jié)腸中都是在第1d定植量最多,十二指腸和空腸中都是在第3d定植得最多。親本株在腸道的定植除在結(jié)腸是第一天定植量最多以外,都發(fā)生在灌胃后期。親本株和突變株主要都是定植在結(jié)腸,十二指腸中最少。在不同腸段,親本株的粘附量均顯著高于突變株(P0.01)。采用CBA技術(shù)通過體內(nèi)、外實驗研究了受試乳酸菌對免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子的影響。結(jié)果表明,發(fā)現(xiàn)親本株與突變株都能在灌胃的中期提高小鼠的免疫器官指數(shù),后期不明顯;均能提高脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,但親本株比突變株更顯著;親本株能顯著提高巨噬細(xì)胞能量水平和吞噬能力(P0.05),突變株作用不顯著。親本株和突變株高劑量時均可以增加機(jī)體對IFN-α的表達(dá)量(P0.01),親本株的表達(dá)效果更顯著,親本株可以增加機(jī)體對IL-10的表達(dá)量(P0.01),而突變株的作用效果不明顯。親本株可以增加機(jī)體對IFN-γ的表達(dá)量,且與劑量及時間有關(guān),高劑量作用顯著(P0.05),突變株作用不明顯。兩種受試乳酸菌在喂養(yǎng)小鼠的整個階段均可提高CD11c+CD80+雙陽性細(xì)胞的細(xì)胞的數(shù)量。
【圖文】：

從而保證了邋Ｒｅｄ重組系統(tǒng)在宿主菌中進(jìn)行瞬時表達(dá)，在完成了靶向基因的敲除的同時也對逡逑宿主菌本身重組系統(tǒng)影響較小。逡逑圖１描述了Ｒｅｄ重組系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除過程。首先是合成一對引物，每一條引物的５＇逡逑端有３５？６０ｂｐ，邋３ｆ端與篩選的基因同源，以抗藥性的質(zhì)粒作為模板，通過ＰＣＲ獲得中間為逡逑一個篩選基因，，它的兩端為３５？６０ｂｐ的同源臂（圖１－１中Ａ和Ｂ）的線性的打靶的ＤＮＡ，把線逡逑性打靶的ＤＮＡ經(jīng)過電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入到含Ｒｅｄ重組系統(tǒng)的宿主菌后，重組系統(tǒng)進(jìn)行適量表達(dá)，入逡逑核酸外切酶就結(jié)合到了線性的打靶的ＤＮＡ兩同源臂末端，酶切產(chǎn)生游離３＇單鏈ＤＮＡ區(qū)逡逑段，從而以鏈侵入的方式使兩同源臂與宿主染色體間發(fā)生重組。線性打靶ＤＮＡ插入到同源逡逑臂Ａ和Ｂ間，而八和８間的ＤＮＡ序列在宿主染色體上被其置換，對靶分子的定向敲除就完成逡逑了，從而獲得靶向基因缺失的突變株。但是篩選基因（通常是抗藥性基因）還存在于缺失突逡逑變株中

２結(jié)果逡逑２．１突變株的構(gòu)建鑒定逡逑圖２－１為突變株片段的ＰＣＲ擴(kuò)增凝膠成像圖。逡逑Ｘ邐Ｍ逡逑Ｍｕ逡逑篡—：二逡逑１１７５——邋＾000逡逑＇邋八S緬義希恚礤義賢跡玻蓖槐渲輳蹋穡冢鄭潁灼蔚模校茫依┰鰣義希疲椋紓玻卞澹校茫義澹幔恚穡歟椋媯椋悖幔簦椋錚鑠澹錚媯蹋穡冢椋穡鄭靛澹媯潁幔紓恚澹睿簦誨澹卞澹蹋穡粒穡潁歟校誨澹停澹停幔潁耄澹蟈義

本文編號：2581177