【摘要】：為了研究鎘脅迫及金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子MTF1(metal transcription factor 1)對斑馬魚(Danio rerio)id1基因的影響和調(diào)節(jié)機(jī)制,本碩士學(xué)位論文分別利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、重組質(zhì)粒的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn),探索了可能發(fā)生的部分調(diào)節(jié)機(jī)制;同時(shí),通過斑馬魚胚胎注射和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的方法,對id1啟動(dòng)子活性的整體情況及體內(nèi)外活性的變化進(jìn)行了研究。具體內(nèi)容如下:1.鎘脅迫斑馬魚后id1基因及mtf基因表達(dá)量變化分別使用0、1/25和1/5LC50鎘對斑馬魚進(jìn)行脅迫,4天后對存活斑馬魚對照組及鎘處理組的肝臟、鰓、腸道、脾臟及腎臟分別取材,提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對各組織中id1、mtf1及mtf2的表達(dá)量變化分別進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,鎘脅迫斑馬魚96 h后,在肝臟組織中,三個(gè)基因表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著性上調(diào):id1在高濃度組顯著性上調(diào)(P0.05),mtf1和mtf2在低濃度組中分別極顯著(P0.01)和顯著上調(diào)(P0.05);在鰓組織中,id1表達(dá)量在高濃度組極顯著升高(P0.01),在低濃度組有上升趨勢,但沒有顯著性變化。mtf1在低濃度組顯著性下調(diào)(P0.05),高濃度組又呈現(xiàn)上調(diào),與對照組基本持平。mtf2與mtf1變化趨勢相同,但與對照組相比沒有顯著性差異;在腸、脾臟、腎臟組織中,三個(gè)基因表達(dá)量在鎘脅迫后均呈現(xiàn)出低濃度組逐漸上升,高濃度組先升后降的趨勢,但均沒有顯著性變化。2.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)體外研究MTF1對id1基因的調(diào)節(jié)機(jī)制因MTF1在其他物種中研究較多,且已被廣泛認(rèn)定為是應(yīng)答金屬脅迫的主要因子。而MTF2研究較少且功能不確定。因此,本論文只研究了MTF1對id1的作用。通過生物信息學(xué)方法對id1基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn),在id1啟動(dòng)子上5’端翻譯起始位點(diǎn)之前約3kb片段中,存在7個(gè)MRE(金屬應(yīng)答調(diào)節(jié)元件)位點(diǎn),并將其以距離ATG位置最近起始,分別命名為MRE1-7;之后,使用半巢式PCR及引物突變PCR的方法構(gòu)建了一系列質(zhì)粒,包括斑馬魚id1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒(ID1-2.8k-PGL3)以及各MRE位點(diǎn)單點(diǎn)突變質(zhì)粒(mMRE1-7PGL-3)、MTF1轉(zhuǎn)錄因子真核表達(dá)質(zhì)粒(MTF1-pcDNA3.1)及其突變體質(zhì)粒dnMTF1-pc DNA3.1。通過質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染鯉魚上皮瘤(epithelioma papulosum cyprinid,EPC)細(xì)胞,使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測MTF1轉(zhuǎn)錄因子(野生型及突變型)對斑馬魚id1啟動(dòng)子(野生型及突變型)活性變化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MTF1對id1啟動(dòng)子的活性影響存在濃度依賴性,表現(xiàn)出低促高抑的趨勢,id1啟動(dòng)子上7個(gè)MRE位點(diǎn)對id1啟動(dòng)子活性的作用存在差異,MRE3、MRE7對id1啟動(dòng)子活性具有負(fù)調(diào)節(jié)作用,MRE1、MRE5對id1啟動(dòng)子活性具有正調(diào)節(jié)作用。3.斑馬魚id1啟動(dòng)子體內(nèi)外活性分析通過構(gòu)建斑馬魚id1啟動(dòng)子不同長度熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,分別以EPC細(xì)胞和斑馬魚胚胎為材料進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染和體內(nèi)注射,并采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對不同長度斑馬魚id1啟動(dòng)子在體內(nèi)、外的活性情況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,不同長度id1啟動(dòng)子活性,在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出隨著啟動(dòng)子長度變化而變化的情況。同時(shí),啟動(dòng)子活性變化趨勢在體內(nèi)和體外并不一致,呈現(xiàn)較大差異性。從研究結(jié)果得出如下結(jié)論:1.鎘對斑馬魚的脅迫可以促進(jìn)肝臟和鰓中id1基因及MTF1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化,表明id1基因和mtf基因在鎘脅迫機(jī)體的應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在各組織中不同的變化表明,鎘脅迫后各組織的應(yīng)激反應(yīng)有所差異,且id1基因及mtf基因的表達(dá)具有組織差異性。在肝臟中,id1基因及mtf基因同時(shí)上調(diào)表明,id1基因的上調(diào)或許和mtf基因的高表達(dá)相關(guān)。2.雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)表明,id1基因可能部分受到MTF1因子的調(diào)節(jié),并且MTF1對id1基因的影響呈現(xiàn)低促高抑的趨勢。對id1啟動(dòng)子上金屬應(yīng)答元件(metal responsive elements,MRE)的突變實(shí)驗(yàn)表明,各MRE元件對id1啟動(dòng)子活性的貢獻(xiàn)不同。3.斑馬魚id1啟動(dòng)子體內(nèi)外活性分析結(jié)果表明,id1啟動(dòng)子活性隨長度變化不同表現(xiàn)各異,說明啟動(dòng)子上存在眾多順式調(diào)控元件。體內(nèi)外活性趨勢的差異表明,不同細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制有所不同,且在體內(nèi)、外id1活性變化受影響的因素有所差異。與體外相比體內(nèi)更為復(fù)雜。體內(nèi)、外id1活性變化不同的結(jié)果,進(jìn)一步印證了鎘脅迫后實(shí)時(shí)熒光定量PCR對id1基因的檢測結(jié)果,即在各組織中id1表達(dá)趨勢存在差異。
【圖文】：

圖 3.1 斑馬魚 MTF1 因子結(jié)構(gòu)示意圖Figure3.1 sketch map of the zebrafish MTF1 structure圖 3.2 斑馬魚 MTF1 突變示意圖Figure3.2 sketch map of the zebrafish MTF1 mutation3.2 結(jié) 果

圖 3.2 斑馬魚 MTF1 突變示意圖Figure3.2 sketch map of the zebrafish MTF1 mutation2 結(jié) 果通過使用半巢式 PCR，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了 id1 啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒 ID1-PGL3.0。用 id1 質(zhì)粒模板，使用 Q5 超保真酶，通過定點(diǎn)突變 PCR 方法成功構(gòu)建了 7 個(gè) M點(diǎn)突變質(zhì)粒：mMRE1、mMRE2、mMRE3、mMRE4、mMRE5、mMRE6、mMRE序結(jié)果表明，突變成功率為 80%（4/5）；通過普通 PCR 成功構(gòu)建了 MTF 轉(zhuǎn)錄真核表達(dá)質(zhì)粒 MTF1-pcDNA3.1-c-myc。同時(shí)，構(gòu)建了 MTF1 轉(zhuǎn)錄活性區(qū)缺失質(zhì)TF1-△TAD-pcDNA3.1-c-myc，在此質(zhì)�；A(chǔ)上，，通過搭橋 PCR 構(gòu)建了 MTF1 突質(zhì)粒 dnMTF1- pcDNA3.1-c-myc。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：X503.225

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳偉;陳

本文編號：2578804