發(fā)布時間：2019-11-27 23:15

【摘要】：柑橘脈突病毒(Citrus vein enation virus,CVEV)是黃矮病毒科(Luteoviridae)豌豆耳突花葉病毒屬(Enamovirus)的一種正義單鏈RNA病毒,引起柑橘脈突病及木瘤病。目前,CVEV在西班牙、南非、澳大利亞、巴西、印度、美國、秘魯和土耳其等多個國家均有發(fā)生,在我國主要分布于浙江黃巖地區(qū)。由于該病毒能由多種蚜蟲傳播,因而具有一定的傳播流行風險。為保障我國柑橘產(chǎn)業(yè)安全,本研究在建立CVEV實時熒光定量RT-PCR檢測方法的基礎上,構建CVEV全長cDNA克隆,分析其侵染性,并開展了CVEV基因沉默抑制子的鑒定,以期為CVEV的流行監(jiān)控、分子生物學及致病機理研究奠定基礎。所取得的主要研究結果如下:1.CVEV實時熒光定量RT-PCR檢測體系的建立本研究通過設計特異性引物(EVqF4/EVqR4),優(yōu)化反應條件,建立了CVEV實時熒光定量RT-PCR檢測體系。該方法特異性良好;靈敏度較高(為常規(guī)RT-PCR的100倍);標準曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關系,相關系數(shù)為0.992,擴增效率為101.8%;檢測組間和組內(nèi)變異系數(shù)均不超過2.85%,重復性較好,適用于檢測田間樣品。2.CVEV在代代酸橙植株中的時空分布應用所建立的實時熒光定量RT-PCR檢測體系對CVEV在代代酸橙中的時空分布進行檢測。結果表明,CVEV在代代酸橙根中,無論春季、夏季或者秋季,其含量相對于其它部位最高,其次是嫩皮;另外,嫩葉、嫩皮和老皮中CVEV含量在春季最高,春、夏、秋依次減少。3.構建CVEV全長cDNA克隆及其序列分析本研究建立了CVEV全基因組一步法RT-PCR擴增體系,并成功獲得其全長cDNA克隆36個。序列比對結果顯示,本研究所獲CVEV全長基因組序列(命名為CVEV-XSH)與已報道的VE-1分離株基因組序列相似度最高,為98.61%;與豌豆耳突花葉病毒-1(Pea enation mosaic virus-1,PEMV-1)和紫花苜蓿耳突病毒(Alfalfa enamovirus-1,AEV)曼菲蒂分離株序列進行比對,其一致性分別為90.46%和90.26%,表明CVEV-XSH基因序列相對保守。根據(jù)全基因組序列構建的進化樹顯示,CVEV-XSH與VE-1、PEMV-1、AEV曼菲蒂分離株聚為一簇,與序列相似性分析結果一致。4.CVEV全長cDNA克隆侵染性分析采用農(nóng)桿菌介導的本生煙接種法,對獲得的36個CVEV全長cDNA克隆進行了侵染實驗。生物學觀察以及分子檢測結果顯示未獲得侵染性克隆。為此,本研究進一步設計實驗,旨在發(fā)掘影響其侵染性的因素。首先,利用5'Race技術獲得末端序列,并對其變異情況進行分析;結果顯示,CVEV 5'端序列保守性極高,未發(fā)現(xiàn)變異存在。其次,采用與CVEV全長cDNA克隆相同的方法構建PVX全長cDNA克隆,成功獲得PVX全長cDNA侵染性克隆,說明本研究所用雙元表達載體pXT1以及構建方法均有效。第三,為避免重組質(zhì)粒在大腸桿菌中存在不穩(wěn)定現(xiàn)象而造成侵染失敗問題,本研究將CVEV全長基因PCR產(chǎn)物與表達載體pXT1連接后,直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌初步得到4個陽性克隆,接種后經(jīng)分子檢測仍未篩選出侵染性克隆。第四,篩選其它草本寄主,即采用毒源葉片汁液摩擦接種豌豆、蠶豆、蕓豆、昆諾藜等草本植株,結果顯示均未表現(xiàn)出侵染性。綜上表明,CVEV全長cDNA克隆侵染失敗并非5'末端序列變異、表達載體以及構建方法所致,而針對重組質(zhì)粒在大腸桿菌中不穩(wěn)定以及寄主影響,或者其它原因造成的侵染失敗,還需進一步分析探究。5.CVEV基因沉默抑制子的初步鑒定本研究在克隆CVEV 5個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)編碼基因的基礎上,構建其重組雙元表達載體,并利用農(nóng)桿菌介導的病毒微型復制子(p35miniBYV-eGFP)共浸潤鑒定法開展了沉默抑制子鑒定試驗。結果顯示:CP表達載體共注射本生煙植株各重復均出現(xiàn)綠色熒光,其熒光強度較負對照強,但與正對照HC-Pro相比較弱,說明CP具有一定的基因沉默抑制作用。其它ORF表達載體共注射植株與負對照相比無明顯差異;進一步經(jīng)實時熒光定量RT-PCR檢測結果顯示,CP表達載體共注射本生煙葉片中GFP相對表達量高于負對照1倍左右,低于正對照,其它基因與負對照相比表達差異不大,CP可初步認定為弱抑制子。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S436.66

【參考文獻】

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本文編號：2566799