【摘要】：本研究基于香樟轉錄組測序數(shù)據(jù),設計特異性引物進行擴增,應用反轉錄RT-PCR技術,克隆獲得香樟合成甲羥戊酸激酶(Mevalonate kinase,MK)的開放讀碼框ORF序列全長。根據(jù)Gibison同源重組的方法將目的基因克隆至pSMART-LCKan載體上,將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序分析以及生物信息學分析。測序結果表明:CcMK基因ORF全長為1 194 bp,編碼397個氨基酸。理化分析可知CcMK蛋白分子式為C_(1852)H_(3027)N_(487)O_(574)S_(17),相對分子質(zhì)量為41 845.34,等電點為5.30。CcMK蛋白是一個定位于細胞質(zhì),不含信號肽的親水性穩(wěn)定蛋白,且含有保守結構域GHMP激酶家族特異性的N末端和C末端。分子進化樹分析結果表明,香樟CcMK蛋白與紅掌、川貝母、野芭蕉、海棗、油棕等植物的蛋白處于同一分支上,親緣關系較近。利用實時熒光定量PCR方法檢測CcMK基因在香樟的葉、莖和根中的表達情況,結果表明,CcMK基因在香樟的葉中表達豐度最高。本研究首次從香樟中克隆了CcMK基因,并對其進行了生物信息學分析,為進一步研究CcMK基因在香樟萜類合成途徑中的作用奠定了理論基礎。
【圖文】：

熱帶作物學報第38卷圖1PCR擴增CcMK基因Fig.1PCRamplificationofCcMKgeneM：5000bpDNAMarker；1、2：CcMK基因擴增產(chǎn)物。M:5000bpDNAMarker;1,2:PCRproductofCcMKgene.5000300020001000bpM12位的表達情況，利用實時熒光定量PCR的方法檢測CcMK基因在香樟葉、莖、根中的表達量，采用BIO-RADCFX96實時PCR檢測系統(tǒng)。使用的引物序列為：CcMK-F：5′-TGAGCGAGCATCCAGGCATC-3′；CcMK-R：5′-TGAAGCAGGCGACTGGATAATG-3′。實時PCR檢測的反應體系參照iQSYBRGreenSuperMix（BIO-RAD）體系，每個反應體系重復3次。PCR程序如下：95℃預變性3min，95℃變性10s，58℃退火15s，72℃延伸20s，共45個循環(huán)DissociationStage。實時PCR反應以香樟肌動蛋白基因CcACT（KM086739.1）為內(nèi)參，內(nèi)參引物序列為：ACTIN1-F：5′-GAGCTACCTGATGGGCAAGTG-3′；ACTIN1-R：5′-AGAACCACCACTAAGCACGATG-3′。組織表達以葉中的表達量為對照。2結果與分析2.1CcMK的基因克隆以香樟的cDNA為模板，PCR擴增得到1200bp左右的片段，電泳結果如圖1所示。顯示目的條帶與預期大小相符，將其克隆至pSMART-LCKan載體上，經(jīng)過陽性克隆篩選，送至上海生工生物公司測序，大小為1194bp，編碼397個氨基酸（圖2）。圖2CcMK基因編碼區(qū)DNA序列及氨基酸序列Fig.2CodingsequenceandaminoacidsequenceofCcMKgenecDNA-2304-

Ｍü烱OSUI在線分析CcMK，結果表明，CcMK蛋白不含信號肽，疏水性平均值為0.290428，疏水性和親水性氨基酸分布均勻，結合跨膜結構域的預測結果，說明CcMK蛋白為水溶性蛋白。2.4CcMK蛋白的結構域分析經(jīng)SMART工具分析，CcMK蛋白中含有兩個保守結構域，即GHMP激酶家族特異的N末端和C末端的保守結構域GHMP激酶的功能域。氨基酸序列的132~213位是GHMP激酶N端區(qū)域。285~365位是GHMP激酶C端的結構域。經(jīng)BlastP預測CcMK編碼蛋白具有1-383個氨基酸之間的MevalonateKinase的功能域（圖5），表明其具有甲羥戊酸激酶的功能。圖5CcMK蛋白保守功能域Fig.5ConserveddomainsofCcMKprotein0100200300397132位-213位GHMP激酶N末端285位-365位GHMP激酶C末端2.5CcMK蛋白的信號肽、亞細胞定位和跨膜結構分析經(jīng)SignalP4.1server預測，CcMK蛋白不含信號肽，為非分泌蛋白（圖6）。經(jīng)TargetP1.1server在線軟件進行亞細胞定位預測表明，氨基酸序列中含有葉綠體轉運肽的可能性為0.016，含有線粒體轉運肽的可能性為0.128，，含有信號肽可能性為0.279，其它可能性為0.541，可靠等級為4，顯示CcMK可能定位于細胞質(zhì)。利用TMHMM軟件預測CcMK蛋白不含跨膜結構域，整條多肽鏈均處于細胞膜外，因此推測CcMK蛋白是不通過蛋白轉運，直接在細胞質(zhì)基質(zhì)0102030405060701.00.80.60.40.20.0ScoreC-scoreS-scoreY-scoreSignalP-4.1prediction(euknetworks):SequencePosition圖6CcMK蛋白信號肽預測分析（SignalP預測）Fig.6PredictionofsignalpeptideofCcMKprotein(SignalPprediction)曹先爽等：香樟MK基因的克隆與生物信息學分析-2307-

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 白雪源,陳香美,邱強;人腎高親和力鈉離子依賴性二羧酸轉運蛋白基因的克隆和生物信息學分析[J];中國生物化學與分子生物學報;2002年04期

2 陳曉華;蔡國平;;人致肺纖維化相關因子的克隆和生物信息學分析[J];生物化學與生物物理進展;2006年07期

3 王銳;趙躍;張永云;李衛(wèi)真;王淑燕;霍海龍;劉麗仙;苗永旺;霍金龍;;豬胰島素樣生長因子-Ⅰ的克隆及生物信息學分析[J];西南農(nóng)業(yè)學報;2014年02期

4 譚從娥;王米渠;馮文哲;徐全壹;;生物信息學分析寒證海量數(shù)據(jù)的探索[J];中華中醫(yī)藥學刊;2008年12期

5 程勇前;成軍;劉妍;王琳;徐東平;鐘彥偉;曲建慧;趙平;;鈣離子調(diào)節(jié)親環(huán)素配體及其不同剪接體的克隆及生物信息學分析[J];醫(yī)學研究生學報;2008年05期

6 盧雪梅;金小寶;朱家勇;沈娟;梅寒芳;馬艷;肖明珠;褚夫江;;人溶菌酶基因的克隆和生物信息學分析[J];生物技術;2010年06期

7 牛偉濤;;家蠶中一未知基因的生物信息學分析[J];邢臺學院學報;2011年02期

8 胡甘雨;司風玲;車燕飛;張玉娟;陳斌;;蔥蠅過氧化氫酶基因的克隆及生物信息學分析[J];西南大學學報(自然科學版);2014年01期

9 楊向東,王仁,劉俊文,唐蔚青,李紅霞,王抒;一個新的人突觸相關蛋白基因的生物信息學分析[J];中國動脈硬化雜志;2004年01期

10 張艷宇,馬平,陸一鳴,呂麗萍,姜升陽,周錫鵬,孫樹漢,許金波;尖吻蝮蛇類凝血酶基因的克隆及生物信息學分析[J];中國實驗血液學雜志;2005年04期

相關會議論文 前10條

1 唐愛發(fā);余振東;桂耀庭;郭新;李賢新;周錦堂;朱輝;蔡志明;;SPACA4基因在人和小鼠的表達及其生物信息學分析[A];遺傳學進步與人口健康高峰論壇論文集[C];2007年

2 劉惠君;譚宇蓉;劉持;向陽;屈飛;秦曉群;;BRS-3相互作用新基因的生物信息學分析及功能研究[A];湖南省生理科學會2008年度學術年會論文摘要匯編[C];2008年

3 黃浩;陸啟軒;陳臨溪;楊莉;毛小環(huán);李蘭芳;秦旭平;曹建剛;;APJ受體的生物信息學分析[A];全國第十二屆生化與分子藥理學學術會議論文集[C];2011年

4 陳大清;吳功慶;李亞男;;淹水脅迫下薏苡根系adh基因的克隆及其生物信息學分析[A];2005'海峽兩岸植物生理與分子生物學教學研討會論文集[C];2005年

5 田琪琳;施定基;賈曉會;王曉燕;黃希文;何培民;;真核藻PEPC的生物信息學分析[A];中國藻類學會第八次會員代表大會暨第十六次學術討論會論文摘要集[C];2011年

6 易樂飛;閻斌倫;王萍;滕亞娟;周向紅;;條斑紫菜HSP70基因克隆與生物信息學分析[A];慶祝中國藻類學會成立30周年暨第十五次學術討論會摘要集[C];2009年

7 張?zhí)?李祥龍;周榮艷;李蘭會;任玉紅;趙駐軍;;不同物種Oct-1基因編碼區(qū)生物信息學分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會養(yǎng)羊學分會2012年全國養(yǎng)羊生產(chǎn)與學術研討會議論文集[C];2012年

8 楊波;盧學春;遲小華;韓為東;于力;樓方定;;基于生物信息學分析人類LRP16基因功能初步研究[A];第12屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2009年

9 王芳;李凱彬;劉坡;劉春;吳淑勤;;劍尾魚補體基因C3全長cDNA克隆與生物信息學分析[A];第九屆中國實驗動物科學年會（2010新疆）論文集[C];2010年

10 周文靈;楊麗霞;李玲;;野葛UDP-葡糖基轉移酶基因克隆與生物信息學分析[A];廣東省植物學會第十七期學術研討會論文集[C];2008年

相關重要報紙文章 前7條

1 汪敏華;成功克隆2.1萬個功能基因[N];解放日報;2004年

2 張學全;克隆人類全長功能基因獲突破[N];中國高新技術產(chǎn)業(yè)導報;2004年

3 本報實習記者 王新佳;基因：改變?nèi)祟惷\的新技術[N];中國高新技術產(chǎn)業(yè)導報;2001年

4 張汝金;發(fā)現(xiàn)37條人類新基因[N];解放軍報;2003年

5 本報實習記者 申音 記者 王旗;基因不是.com[N];中國經(jīng)營報;2000年

6 本報記者 周立文 本報通訊員 丁學國;中國基因三個人物與一個事業(yè)[N];光明日報;2000年

7 記者 張學全;克隆人類全長功能基因獲得重大進展[N];新華每日電訊;2004年

相關博士學位論文 前10條

1 陳蕾;原始蛋白酶結構功能的生物信息學分析及化學基礎[D];山東師范大學;2009年

2 蘇志熙;幾種哺乳動物表達序列標簽（EST）生物信息學分析[D];浙江大學;2006年

3 趙佳媛;靈長類二氧化碳感知通路相關基因的進化及生物信息學分析[D];復旦大學;2010年

4 蔣桂雄;油桐種子轉錄組解析及油脂合成重要基因克隆[D];中南林業(yè)科技大學;2015年

5 張高華;獐茅離子轉運蛋白基因AlNHX1與AlHAK1的克隆與表達研究[D];大連理工大學;2008年

6 王學仁;擔子菌毛頭鬼傘的TMV抗性蛋白y3基因的分離、鑒定和表達[D];西北大學;2010年

7 呂鴻雁;枯草芽孢桿菌中甲硫氨酸氨基肽酶基因的克隆與功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2002年

8 蘇偉;水稻程序性細胞死亡相關基因的克隆和功能分析[D];復旦大學;2006年

9 溫建國;灰飛虱免疫相關基因及微管蛋白基因的克隆和分子鑒定[D];復旦大學;2004年

10 李梅章;人類新基因的分離和鑒定研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2000年

相關碩士學位論文 前10條

1 楊蓓;豬TTV1-ORF1和TTV2-ORF1基因的克隆、表達及生物信息學分析[D];石河子大學;2015年

2 張?zhí)旌?果蠅miRNA-92a進化保守性及其靶基因功能的生物信息學分析[D];南京師范大學;2015年

3 智倩;一株桿菌產(chǎn)脂肪酶基因的克隆及生物信息學分析[D];大連工業(yè)大學;2013年

4 陳晨;基于文獻挖掘的前列腺癌蛋白組學差異表達蛋白的生物信息學分析[D];華北理工大學;2016年

5 徐冉;紫球藻Lhc基因的克隆及其生物信息學和表達分析[D];遼寧師范大學;2016年

6 謝秒秒;紅三葉草壞死花葉病毒外殼蛋白的表達、純化及生物信息學分析[D];西北農(nóng)林科技大學;2016年

7 何姣;楊凌糖絲菌Hhs.015幾丁質(zhì)酶基因的生物信息學分析及功能驗證[D];西北農(nóng)林科技大學;2016年

8 曹峰;小鼠胚胎干細胞核心轉錄因子調(diào)控網(wǎng)絡的生物信息學分析[D];西北農(nóng)林科技大學;2008年

9 王翊;CEM15基因的生物信息學分析[D];電子科技大學;2005年

10 王芳;一個家蠅未知功能基因的克隆及其生物信息學分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2011年

本文編號：2566566