發(fā)布時間：2019-11-07 22:24

【摘要】：掌葉半夏凝集素(Pinellia Pedatisecta Agglutinin,PPA)屬于單子葉甘露糖結合凝集素。為研究掌葉半夏凝集素基因的功能,本論文以CAMV 35S啟動子和擬南芥韌皮部特異性表達啟動子AtPP2驅動下的5個掌葉半夏凝集素基因的轉基因煙草為材料進行以下研究：以實驗室前期獲得的CAMV 35S驅動下的5個凝集素轉基因煙草和AtPP2啟動子驅動下的5個凝集素轉基因煙草T0代植株為材料,分別進行Basta抗性篩選以及分子鑒定,共獲得各單位點插入轉基因株系如下：35S-PPA-2：3個,35S-PPA-3:3個,35S-PPA-4:7個,35S.PPA-5:9個,35S-PPA-6:5個,AtPP2-PPA-3:4個,AtPP2-PPA-4:3個,AtPP2-PPA-5:3個,AtPP2-PPA-6:3個；對獲得的單位點插入轉基因煙草T1代植株自交繁育后代種子,在35S-PPA-5和AtPP2-PPA-5轉基因煙草T3代中繼續(xù)進行Basta抗性鑒定,共獲得10株35S-PPA-5轉基因純合煙草,6株AtPP2-PPA-5轉基因純合煙草；以35S-PPA-5和AtPP2-PPA-5轉基因煙草T3代純合植株為材料,通過western-blot分析,將獲得的純合轉基因株系按蛋白表達水平分成高、中、低三類進行抗蚜試驗,結果表明這些轉基因煙草均具有顯著的抗蚜效果,35S-PPA-5轉基因植株平均抑蚜率為84.8%,高蛋白表達量的轉基因植株抑蚜率高達99.37%；而AtPP2-PPA-5轉基因植株平均抑蚜率為53.78%,高蛋白表達量的轉基因植株抑蚜率為59.95%,三種蛋白表達類型的AtPP2-PPA-5轉基因植株普遍低于35S啟動子驅動下的轉基因植株；PPA-5可以作為高效抗蚜候選基因,具有很高的抗蚜效果；某些單子葉甘露糖結合凝集素不僅具有抗蟲作用,還具有抗病原菌和線蟲的作用,為研究PPA-5是否也具有抗病作用,以蛋白表達量高的35S-PPA-5轉基因煙草T3代純合植株為材料,接種棉花黃萎病致病菌,發(fā)現(xiàn)病斑較對照明顯減少,說明PPA蛋白可能具有抗黃萎病活性；目前關于掌葉半夏凝集素基因原核表達的研究極少,為在蛋白水平研究PPA-5的功能,通過對PPA-5的生物學信息分析切除了該蛋白序列前22個氨基酸的信號肽序列,然后將切割的PPA-5基因(△PPA-5)經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切,構建了重組表達質(zhì)粒載體pGEX-6p-1-ΔPPA-5,轉入表達菌株Rosetta(DE3)中成功表達,并將純化得到的PPA-5蛋白采用對峙法進行黃萎病菌抑菌試驗,試驗結果進一步確定了PPA的抑菌活性；
【學位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

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本文編號：2557502