【摘要】：哺乳動物的研究顯示,hepcidin兼具機體鐵平衡調(diào)節(jié)與抗菌功能。Hepcidin基因在進(jìn)化上較為保守,從魚類到哺乳類均有存在,研究者在多種魚類發(fā)現(xiàn)hepcidin有多亞型現(xiàn)象。至今對魚類有關(guān)hepcidin的研究尚不夠系統(tǒng)、深入,尤其是不同亞型hepcidin的生物學(xué)功能及基因表達(dá)調(diào)控是否存在差異或生物學(xué)互補效應(yīng)等有待闡明。彈涂魚生態(tài)習(xí)性特別,具有兩棲性,能夠較好適應(yīng)水生與陸生條件下不同氧供給狀態(tài),該種魚生活于泥灘,接觸各種病原體的機會多,推測其免疫機能較強。本文以大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)為對象,研究其hepcidin的基因結(jié)構(gòu)、5'側(cè)翼序列,分析其特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,并初步研究hepcidin的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與抑菌活性,為闡明魚類hepcidin的生物學(xué)活性及基因表達(dá)調(diào)控提供資料。本研究克隆了大彈涂魚Hepcidin基因家族的兩個亞型,即bpHep-1和bpHep-2的cDNA全長及基因序列。推導(dǎo)bp Hep-1前多肽原有88aa,包含信號肽22aa,前肽40aa,成熟肽26aa;bpHep-2前多肽原也由88aa組成,包含信號肽24aa,前肽42aa,成熟肽22aa。兩個亞型的成熟肽中都含有8個Cys可形成4對二硫鍵。分子系統(tǒng)學(xué)分析顯示,基于魚類Hepcidin的進(jìn)化樹(neighbor joining tree,NJ tree)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與基于多個核基因?qū)︳~類系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)吻合,骨鰾魚亞部魚類Hepcidin以88%高支持率獨立聚支,為真真骨魚亞部(Euteleostei)的姐妹群。真真骨魚亞部中,進(jìn)化地位相對較低的原棘鰭總目(Protacanthopterygii)以72%的支持率獨立聚支,為新真骨魚類(Neoteleostei)的姐妹群。在新真骨魚類中,多種魚類中具有多個hepcidin亞型,總體上以低支持率聚為2支,命名為Neo1和Neo2。大彈涂魚bpHep-1歸于Neo1,在成熟肽的N端均含有較為保守推測與鐵代謝調(diào)節(jié)有關(guān)的基序[Q-S/I-H-L/I-S/A],bp Hep-2歸入所有hepcidin序列均無該基序的Neo2。bpHep-1及bpHep-2的基因均含3個外顯子和2個內(nèi)含子,Exon 1包含5’UTR、信號肽和部分前肽序列,前肽從Exon 1跨越Exon 2一直延伸到Exon 3,Exon 3包含部分的前肽編碼序列及3’UTR。bp Hep-1 cDNA的全長序列為573bp,包含267bp的開放閱讀框,位于一側(cè)的152bp的5’UTR和另一側(cè)的154bp的3’UTR。bp Hep-2 cDNA的全長序列為598bp,包含267bp的開放閱讀框,位于一側(cè)的76bp的5’UTR和另一側(cè)的74bp的3’UTR。bp Hep-1和bpHep-2轉(zhuǎn)錄起始位點上游-25~-30bp都存在TATA框(TATA box)。通過在線生物信息學(xué)軟件分析,bpHep-1在-1341bp/+152 bp啟動子區(qū)域存在23個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,bpHep-2啟動子在-1870bp/+75區(qū)域存在37個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。bpHep-1和bpHep-2都含有C/EBPalp、SP1、Oct-1、HNF-3、TBP、GR、W T1 I-K等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,其中C/EBPalp已被證明是哺乳動物hepcidin的有效轉(zhuǎn)錄激活因子,HNF-3是肝和內(nèi)臟基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,推測這幾個轉(zhuǎn)錄因子在hepcidin表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用。bpHep-2啟動子區(qū)域含有NF-κB結(jié)合位點,而bpHep-1無該位點,NF-κB是固有免疫因子的表達(dá)的信號通路,推測bpHep-2在固有免疫中發(fā)揮著的作用較bpHep-1更重要。利用半定量PCR和熒光定量PCR技術(shù),檢測bpHep-1和bpHep-2在大彈涂魚肝、腸、鰓、頭腎和小腸等組織中均有表達(dá),特別是在肝組織中,其表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織,并且肝組織bpHep-2的相對表達(dá)量顯著高于bpHep-1。注射LPS、poly(I:C)、0.1mg/g右旋糖酐鐵對bpHep-1和bpHep-2在各組織的表達(dá)沒有顯著影響,而0.5mg/g右旋糖酐鐵刺激24h后,bp Hep-1基因在腸、頭腎和脾組織中的表達(dá)量顯著性上調(diào),bpHep-2在鰓、腸、頭腎和脾的組織中顯著性上調(diào)。這提示兩種亞型都可能參與了鐵代謝的調(diào)節(jié)。應(yīng)用pET-SUMO大腸桿菌表達(dá)載體,成功的將bp Hep-1和bpHep-2成熟肽基因片段連接至pET-SUMO載體,通過原核大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)出來的兩個抗菌肽再通過抑菌實驗對其生物活性驗證,濃度為12.5μM的bp Hep-1和bpHep-2即對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的生長顯示出抑制效應(yīng)。綜上所述,本研究在克隆彈涂魚hepcidin兩個基因亞型的的基礎(chǔ)上,對推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)分析,對基因側(cè)翼序列進(jìn)行了啟動子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析,為深入研究魚類hepcidin的功能奠定了重要基礎(chǔ)。研究了bp Hep-1和bpHep-2在彈涂魚不同組織中的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平,并探究了在體內(nèi)注射免疫刺激物L(fēng)PS、PolyI:C以及不同劑量的Fe2+對bpHep-1和bpHep-2基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,發(fā)現(xiàn)高劑量的Fe2+對兩個亞型都具有上調(diào)作用,但呈組織特異性。此外,構(gòu)建了pET-SUMO-bpHep-1和pET-SUMO-bpHep-2原核表達(dá)載體,并成功表達(dá)了bpHep-1和bpHep-2。
【圖文】：

圖1-1 Hepcidin參與調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)示意圖（引自牛詩雯等[46]）注: A:鐵過載時 B:鐵不足時1.3.4 低氧對 Hepcidin 的表達(dá)研究表明，缺氧會影響機體對鐵的吸收，當(dāng)體內(nèi)鐵含量比較低時，Hepcidin的表達(dá)量將會減少。Nicolas 等在 2002 年首次報道了低氧條件下培養(yǎng)的 HepG2 細(xì)胞與在正常氧含量的情況下相比，其Hepcidin mRNA 表達(dá)水平明顯降低[47]。但是關(guān)于低氧與Hepcidin表達(dá)降低的分子機制目前還不是很清楚。其中一種說法是，低氧主要是依靠缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）來抑制 hepcidin 的表達(dá)，HIFs與Hepcidin基因的上游調(diào)控區(qū)域結(jié)合從而使hepcidin表達(dá)降低[48]。在低氧的環(huán)境中，HIFs也會間接的影響促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）等基因的表達(dá)，從而間接的使 Hepcidin 的表達(dá)受到抑制[49]。1.4 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

bpHep-1 基因前部分序列約為 1542bp 和后部分序列約為 1416bp 的片段，bpHep-2 前部分序列約為 1793bp 和基因序列約為 796bp 的片段，，這與預(yù)期的結(jié)果一致。圖2-1 大彈涂魚肝臟基因組注:M.500-1,5000bpDNAladderMarker;1,2: 大彈涂魚肝臟基因組DNA
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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本文編號：2557409