【摘要】：背景類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種累及周圍多關(guān)節(jié)和滑膜的全身性自身免疫性疾病,主要特征為大量T淋巴細胞浸潤,持續(xù)性滑膜炎和關(guān)節(jié)炎,最終造成關(guān)節(jié)不可逆的損傷。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種累及全身多臟器的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,主要特征為大量的自身抗體產(chǎn)生,補體激活和免疫復合物累積,進而導致組織和器官損傷。盡管RA和SLE的發(fā)病機制至今尚未闡明,但許多研究已證實,多種風險因素共同作用導致發(fā)病,其中遺傳因素在疾病發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用。雖然目前發(fā)現(xiàn)了較多與RA和SLE遺傳易感性具有強關(guān)聯(lián)的基因,然而此類疾病的遺傳度并不能完全由這些已發(fā)現(xiàn)的易感基因所解釋。一些潛在的遺傳因素如基因-基因間的交互作用則可解釋部分“缺失的遺傳度”。既往研究表明Th17(T helper 17,Th17)細胞及其相關(guān)細胞因子在RA和SLE的發(fā)病和疾病進展中均扮演了重要角色。相關(guān)研究證據(jù)顯示多個參與Th17細胞反應(yīng)調(diào)控的基因存在變異且與RA和SLE的遺傳易感性相關(guān),這些易感位點的發(fā)現(xiàn)從遺傳學的角度進一步驗證了Th17通路在RA和SLE發(fā)病中的關(guān)鍵性作用。最新證據(jù)發(fā)現(xiàn)Th17細胞相關(guān)基因二肽基肽酶4(dipeptidylpeptidase 4,DPP4)、趨化因子受體6(chemokine[C-C motif]receptor 6,CCR6)、白介素6受體(interleukin 6 receptor,IL6R)和白介素23受體(interleukin-23 receptor,IL23R)均是RA的易感基因,其中CD26和CCR6是Th17細胞重要的表面分子標志物,IL6R和IL23R則是Th17細胞信號網(wǎng)絡(luò)中的重要細胞因子受體。近年來,研究發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病存在著許多共同的遺傳易感基因,提示此類疾病可能存在著共同分子致病機制和生物學通路。此外,易感基因在RA和SLE中存在的基因-基因交互作用相繼被發(fā)現(xiàn),其中本課題組前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Th17細胞通路的兩個基因IL21(interleukin-21)和ETS1(E26transformation-specific-1)在SLE中存在交互作用。因此我們擬在中國漢族人群中研究Th17細胞相關(guān)基因DPP4、CCR6、IL6R和IL23R在RA和SLE中可能存在的交互作用。目的本研究擬通過檢測RA和SLE病例與正常對照的Th17信號通路相關(guān)基因位點(DPP4 rs12617656、CCR6 rs1854853、IL6R rs2228145和IL23R rs7517847)的多態(tài)性,驗證其與中國漢族人群RA遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性,以及研究其與SLE遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性,并進一步分析DPP4、CCR6、IL6R和IL23R在RA和SLE中可能存在的基因-基因交互作用。方法本課題采用病例對照研究設(shè)計方案,分兩階段進行研究,第一階段,通過收集RA、SLE和正常對照相關(guān)資料和血液標本,利用Fluidigm 192.24 Dynamic Array儀和Taq Man探針進行基因分型檢測,分析DPP4 rs12617656、CCR6rs1854853、IL6R rs2228145和IL23R rs7517847的多態(tài)性與RA和SLE遺傳易感性,以及與RA重要亞型和SLE主要臨床特征之間的關(guān)聯(lián)性,并進一步探索基因間存在的交互作用。第二階段,基于第一階段發(fā)現(xiàn)的基因-基因交互作用,再次收取獨立樣本(RA、SLE及正常對照),同時進行基因分型檢測和酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),進一步驗證發(fā)現(xiàn)的基因-基因交互效應(yīng)以及初步探討交互效應(yīng)與血漿Th17細胞相關(guān)細胞因子(IL-17、IL-21和IL-22)的關(guān)聯(lián)性。RA、SLE樣本來源于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科和安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院風濕免疫科的門診或住院患者,RA診斷依據(jù)為美國風濕協(xié)會(American College of Rheumatology,ACR)1987年修訂的RA分類標準;SLE診斷依據(jù)則為ACR 1997年修訂的SLE分類標準。正常對照樣本主要來自于健康獻血員和醫(yī)院體檢中心的正常體檢人員,健康對照的選取需符合既定的標準。利用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)強度用比值比(odds ratio,OR)及95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)表達,運用卡方檢驗和Logistic回歸分析方法評估目標基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與RA和SLE遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性。利用Logistic回歸分析方法評估相乘模型的基因-基因交互作用,根據(jù)叉生分析表,并結(jié)合交互作用歸因比(attributable proportion due to interaction,AP)和交互作用超額相對危險度(the relative excess risk due to interaction,RERI)兩個指標評估相加模型的基因-基因交互作用�；蚪M合與血漿細胞因子水平關(guān)聯(lián)性研究則根據(jù)資料的類型進行分析,多組資料間比較符合正態(tài)分布且方差齊性的資料采用方差分析,不符合正態(tài)分布的資料采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。結(jié)果(1)第一階段共納入2452個樣本(RA 386例,SLE 1058例和正常對照1008例)進行分析,驗證了DPP4 rs12617656多態(tài)性與中國漢族人群RA遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性(T vs.C:P=0.004,OR=1.290,95%CI=1.087-1.530),并進一步驗證了DPP4 rs12617656多態(tài)性與抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-citrullinated protein antibodies,ACPA)陽性RA遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性(TT vs.TC+CC:P=0.006,OR=1.697,95%CI=1.167-2.467;TT vs.TC vs.CC:P=0.012,OR=1.285,95%CI=1.056-1.563),發(fā)現(xiàn)了DPP4 rs12617656多態(tài)性與類風濕因子(rheumatoid factor,RF)陽性RA遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性(TT vs.TC+CC:P=0.011,OR=1.649,95%CI=1.124-2.419;TT vs.TC vs.CC:P=0.028,OR=1.253,95%CI=1.025-1.532)。此外,發(fā)現(xiàn)了IL6R rs2228145多態(tài)性與RA、RF陽性RA遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性(CC vs.CA+AA:P=0.049,OR=1.376,95%CI=1.002-1.891;TT vs.TC+CC:P=0.030,OR=1.476,95%CI=1.038-2.097)。另外,研究發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與SLE遺傳易感性之間存在關(guān)聯(lián)性(T vs.C:P=0.039,OR=1.144,95%CI=1.007-1.299)。(2)第一階段RA中基因-基因交互作用研究,發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與CCR6rs1854853存在著相乘模型的交互作用(共顯性模型:P=0.014)和相加模型的交互作用(AP=0.425,95%CI=0.026-0.824),并發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與CCR6 rs1854853在ACPA陽性RA中存在相乘模型的交互作用(顯性模型:P=0.030,OR=2.054,95%CI=1.071-3.943;共顯性模型:P=0.002,OR=1.555,95%CI=1.176-2.054)和相加模型的交互作用(AP=0.534,95%CI=0.185-0.882);在RF陽性RA中也存在著相乘模型的交互作用(顯性模型:P=0.020,OR=1.405,95%CI=1.056-1.870)和相加模型的交互作用(AP=0.459,95%CI=0.045-0.874)。此外,我們發(fā)現(xiàn)了另外一組基因(DPP4 rs12617656與IL6R rs2228145)在RA中存在著相乘模型的交互作用(共顯性模型:P=0.031);在RF陽性RA中存在相乘模型的交互作用(顯性模型:P=0.034;共顯性模型:P=0.010)。(3)第一階段SLE中基因-基因交互作用研究,發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與IL6R rs2228145存在相乘模型的交互作用(隱性模型:P=0.003;共顯性模型:P=0.002)和相加模型的交互作用(AP=0.686,95%CI=0.436-0.936)。(4)第二階段獨立樣本基因-基因交互作用研究,進一步驗證了DPP4rs12617656與CCR6 rs1854853在RA存在相乘模型的交互作用(隱性模型:P=0.001)和相加模型的交互作用(AP=1.088,95%CI=0.859-1.318)。此階段研究未發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與IL6R rs2228145在RA和SLE中存在基因-基因交互作用。(5)兩階段樣本合并基因-基因交互作用研究,發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與CCR6 rs1854853在RA、ACPA陽性RA中,存在著相乘模型和相加模型的交互作用;DPP4 rs12617656與IL6R rs2228145在RF陽性RA中存在相乘模型的交互作用,以及在SLE中存在相乘模型和相加模型的交互作用。(6)基因組合與血漿Th17相關(guān)細胞因子(IL-17、IL-21、IL-22)水平及疾病活動度的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果,未發(fā)現(xiàn)研究基因組合與血漿Th17細胞相關(guān)細胞因子(IL-17、IL-21、IL-22)水平及疾病活動度的關(guān)聯(lián)性。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)并驗證了DPP4 rs12617656與CCR6 rs1854853在RA中可能存在的基因-基因交互作用,同時發(fā)現(xiàn)了DPP4 rs12617656與IL6R rs2228145在RA和SLE中可能同時存在的基因-基因交互作用,提示Th17細胞相關(guān)基因在RA和SLE發(fā)生和發(fā)展中可能存在協(xié)同作用,進一步說明了Th17細胞信號通路在自身免疫性疾病尤其在RA和SLE發(fā)病機制中起著重要作用。
【圖文】：

本課題的主要技術(shù)路線

DAS28關(guān)節(jié)評價指標Figure2EvaluationofthejointsinDAS28
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22

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本文編號：2556419