發(fā)布時間：2019-11-06 03:08

【摘要】：【目的】研究新疆紅肉蘋果雜種一代優(yōu)系‘紅脆1號’液泡膜葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因MdVGT1生物學(xué)信息、表達水平及其在糖代謝中的功能,旨在為進一步完善功能型蘋果育種的理論與技術(shù)體系提供參考�！痉椒ā恳孕陆t肉蘋果雜種一代優(yōu)系‘紅脆1號’為試材,克隆MdVGT1,對其進行生物信息學(xué)分析;并采用熒光定量PCR分析該基因在不同組織及不同發(fā)育時期的表達,分析‘嘎啦’組培苗中該基因在葡萄糖誘導(dǎo)下的表達,通過酵母雙雜交驗證其互作關(guān)系,并通過原核誘導(dǎo)獲得重組蛋白�！窘Y(jié)果】在‘紅脆1號’中克隆獲得MdVGT1全長,測序發(fā)現(xiàn)其包含1 506 bp完整的開放閱讀框,編碼501個氨基酸,預(yù)測其編碼蛋白質(zhì)分子量為53.16 kD,等電點為5.92,定位于蘋果基因組的1號染色體上,由14個外顯子和13個內(nèi)含子構(gòu)成;糖代謝相關(guān)基因系統(tǒng)進化樹分析表明,MdVGT1與AtVGT1、VvVGT1、CsVGT1在同一個進化枝上,功能域分析表明,MdVGT1蛋白含有12個跨膜區(qū)域;MdVGT1在蘋果的花、葉和幼果中均有較高的表達,在果實發(fā)育中,其表達量與葡萄糖含量有顯著的相關(guān)性;MdVGT1啟動子含有與抗逆、糖信號及激素信號相關(guān)的順式作用元件;葡萄糖處理‘嘎啦’組培苗一周后,MdVGT1的表達量明顯提高;酵母雙雜交試驗表明,MdVGT1與MdTMT1在體外能相互作用,并通過原核誘導(dǎo)獲得了MdVGT1的重組蛋白�！窘Y(jié)論】在‘紅脆1號’蘋果中克隆獲得了液泡膜葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因MdVGT1,其可能與MdTMT1互作共同轉(zhuǎn)運葡萄糖進入液泡膜。
【圖文】：

進行雙酶切，構(gòu)建原核重組表達載體pET28a-MdVGT1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DE3感受態(tài)中。加入1mmol·L-1IPTG后分別在0、2、4、6h時取樣于4℃暫時保存，取6h菌液離心收集菌體，用8mLPBS緩沖液懸浮，超聲破碎（打6s，停9s，25個循環(huán)）分離可溶性蛋白和包涵體，SDS-PAGE電泳檢測。1.7數(shù)據(jù)分析用Excel2007進行作圖和數(shù)據(jù)分析，DPS7.05軟件進行顯著性分析，Spss進行相關(guān)性分析。2結(jié)果2.1MdVGT1的克隆與基因組結(jié)構(gòu)分析如圖1所示，獲得了一條大小約為1500bp的條帶，，與預(yù)期大小一致，序列測定與分析表明，MdVGT1圖1MdVGT1編碼區(qū)全長的RT-PCR擴增Fig.1AgarosegelelectrophoresisofMdVGT1RT-PCRproducts

蛋白基因MdVGT1的克隆與表達分析4587的完整開放閱讀框長度為1506bp，編碼501個氨基酸，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為53.16kD，等電點為5.92。利用GDR數(shù)據(jù)庫（http：//www.rosaceae.org/）分析MdVGT1的染色體位置和基因結(jié)構(gòu)。如圖2所示，MdVGT1位于蘋果基因組的1號染色體上，由14個外顯子和13個內(nèi)含子構(gòu)成。2.2MdVGT1的進化樹和結(jié)構(gòu)功能域如圖3所示，液泡單糖轉(zhuǎn)運蛋白TMT和蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白SUT/SUC分別在不同物種間都在同一個進化樹枝上，因其具有相同的功能。而MdVGT1和擬南芥AtVGT1同樣在同一個進化樹枝上，推測蘋果MdVGT1圖2MdVGT1染色體定位和基因組結(jié)構(gòu)Fig.2ChromosomallocationandgenomicstructureoftheMdVGT1圖3糖代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.3Phylogenetictreeofrelativetransporteringlycometabolism與擬南芥AtVGT1的功能相似（圖3中比例尺0.1代表每10個氨基酸有1個不同）。SMART功能域分析表明MdVGT1有12個跨膜區(qū)域。2.3MdVGT1組織表達特性及果實發(fā)育過程中MdVGT1表達量與葡萄糖含量相關(guān)性由圖4可得，MdVGT1在根、莖、葉、花、果實中都有表達，其中在葉、花和果實中具有較高的表達。由圖5可得，MdVGT1表達量和葡萄糖含量均在花后120d達到最大值，經(jīng)Spss顯著性分析可得，MdVGT1表達量和葡萄糖含量在0.05水平上顯著相關(guān)（顯著性系數(shù)為0.986）。2.4MdVGT1啟動子順式作用元件和葡萄糖處理‘嘎啦’組培苗MdVGT1的表達利用https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid=&lang=en&pj=640&action=page&page=newplace網(wǎng)址分析MdVGT1啟動子的順式作用元件，結(jié)果如表1。MdVGT1啟動子序列含有多個與抗逆性相關(guān)的作用元件：ACGTATERD1和MYBCORE是與脫水相關(guān)的元件[19-21]，MYB1LEPR是與防御相關(guān)的元件[22]，

【相似文獻】

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1 姚秋菊;張曉偉;呂中偉;魏國強;;硅對鹽脅迫下黃瓜幼苗根系質(zhì)膜、液泡膜酶活性的影響[J];華北農(nóng)學(xué)報;2008年06期

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1 鄭乾明;甜橙糖轉(zhuǎn)運子基因分離及其在果實糖積累中的功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2556494