【摘要】：嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)是生物浸礦應(yīng)用中最為重要的微生物之一,A.ferrooxidans對多種重金屬都具有很高的耐受能力。通過研究其重金屬抗性機制,對深入了解微生物細胞維持體內(nèi)重金屬平衡的機理非常重要。目前,A.ferrooxidans銅、鎘代謝機理的遺傳學(xué)研究報道還比較少。A.ferrooxidans中許多與金屬抗性相關(guān)基因的研究大多集中于生物信息學(xué)預(yù)測,缺乏相應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)支持,因而我們在A.ferrooxidans全基因組注釋信息中挑選了三個與金屬抗性相關(guān)的基因,分析了其氨基酸序列信息,同時分別構(gòu)建了這些基因的過表達菌株,為探究這些基因的具體生物學(xué)功能提供實驗數(shù)據(jù)支持。研究工作主要有以下幾個方面:1、本實驗室從甘肅省蘭州市七里河區(qū)阿干鎮(zhèn)煤礦收集酸性礦坑廢水分離純化得到一株A.ferrooxidans L1,革蘭氏陰性菌,短桿狀;該菌株以Fe~(2+)為能源物質(zhì),且具有較高的硫氧化活性,其生長曲線特征顯示延滯期較長,約43 h,穩(wěn)定期約14 h;生長70 h后進入衰亡期;通過馴化試驗,該菌株對不同重金屬離子顯示出不同的耐受能力:在相同培養(yǎng)條件下,Cu~(2+)、Cd~(2+)對A.ferrooxidans L1生長的抑制作用大小為Cu~(2+)Cd~(2+),最高耐受濃度分別是0.04 mol/L和0.08 mol/L。2、運用生物信息學(xué)在線分析軟件對基因編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、功能結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)發(fā)育以及可能參與的代謝通路等進行了預(yù)測。推測AFE-1948、AFE-1862、AFE-RS11495這三種蛋白均分布在胞外或細胞膜上,參與金屬離子的吸附轉(zhuǎn)運等機制。3、為探究A.ferrooxidans中AFE-1948、AFE-1862、AFE-RS11495的功能特性,以本實驗室分離鑒定的A.ferrooxidans L1為材料,采用PCR擴增技術(shù)克隆了afe-1948、afe-1862、afe-RS11495基因。將其轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),通過SDS-PAGE分析,確定其在大腸桿菌中的最佳表達條件。4、為了進一步地了解這三個基因的功能,采用過表達分析的方法考察了其轉(zhuǎn)入受體菌之后的抗性的變化。結(jié)果表明:在不同濃度Cu~(2+)、Cd~(2+)脅迫下,E.coli BL21導(dǎo)入目的基因后,相對于對照組,菌體的生物量明顯下降,說明其抗性下降,但是其胞內(nèi)目的蛋白的含量卻有所增加,推測是由于導(dǎo)入目的基因后胞內(nèi)重金屬的含量明顯上升導(dǎo)致的。
【圖文】：

中的金屬離子吸附在細胞壁、胞外聚合物和細胞膜上（如圖1.1 所示）。例如，Valls 報道[42]，熒光假單胞菌對 Cd2+吸附主要是細胞壁發(fā)揮作用，細胞質(zhì)和胞外聚合物對 Cd2+的吸附作用較小。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌銅、鎘抗性相關(guān)基因的克隆與過表達分析3.1 菌株形態(tài)特征菌株 L1 可在 pH 2.0 的 9K 液體培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)基由無色變?yōu)樽厣始t棕色，隨著時間的延長，培養(yǎng)基中的部分 Fe2+被氧化為 Fe3+并產(chǎn)生了黃礬，培養(yǎng)基變渾濁，產(chǎn)生部分沉淀。革蘭氏染色結(jié)果表明 L1 菌體染色后呈色，為革蘭氏陰性細菌(如圖 2.1A)。掃描電鏡結(jié)果顯示該菌株表面光滑，兩圓，呈短桿狀，長約 1.2-1.5 μm，寬約 0.3-0.4 μm，屬于桿狀菌(如圖 2.1B此推測該菌株為化能自養(yǎng)型的嗜酸桿菌。
【學(xué)位授予單位】：蘭州理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q93;Q78

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