【摘要】：【目的】獲得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶(c AMP phosphodiesterase,PDE)基因,并分析其在病菌侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育過(guò)程及侵染寄主早期階段中的表達(dá),為深入探索c AMP信號(hào)途徑調(diào)控病菌致病性的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)�！痉椒ā扛鶕�(jù)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、綠僵菌(Metarhizium anisopliae)和黑曲霉(Aspergillus niger)6種真菌PDE基因的保守序列,利用簡(jiǎn)并引物PCR對(duì)基因保守片段進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)合RACE和Genome Walking技術(shù)獲得基因全長(zhǎng)及其側(cè)翼序列;利用MEGA 5.0軟件對(duì)PDE蛋白預(yù)測(cè)編碼產(chǎn)物進(jìn)行多重序列比對(duì),并采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);利用GSDS分析基因結(jié)構(gòu),Prot Param分析理化性質(zhì),SOMPA預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu),SMART數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析保守結(jié)構(gòu)域;收集人造疏水介質(zhì)誘導(dǎo)下侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育不同時(shí)期以及侵染感病寄主葉片不同時(shí)間的玉米大斑病菌材料,利用q RT-PCR技術(shù)研究StPDE在病菌侵染結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中不同階段的轉(zhuǎn)錄水平�！窘Y(jié)果】玉米大斑病菌基因組中存在1個(gè)高親和力磷酸二酯酶基因(StH-PDE)和1個(gè)低親和力磷酸二酯酶基因(StL-PDE)。其中,StH-PDE全長(zhǎng)3 208 bp,包含5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子,ORF為2 898 bp。StL-PDE全長(zhǎng)5054 bp,包含4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子,ORF為3 090 bp。StH-PDE和StL-PDE分別含有保守的Ⅰ型和Ⅱ型c AMP磷酸二酯酶催化結(jié)構(gòu)域。不同的植物病原真菌中PDE同源基因分別呈現(xiàn)出高度的相似性,其中,StH-PDE與Magnaporthe grisea、Cordyceps militaris、Metarhizium acridum等病原真菌的高親和力磷酸二酯酶基因聚于同一進(jìn)化支,StL-PDE與Ascochyta rabiri、Scedosporium apiospermum、Fusarium oxysporum、Metarhizium album等病原真菌的低親和力磷酸二酯酶基因聚于相同進(jìn)化支。人造疏水介質(zhì)誘導(dǎo)下,與菌絲相比,StH-PDE和StL-PDE在分生孢子中的表達(dá)水平均顯著上調(diào),其中StH-PDE和StL-PDE分別上調(diào)了約2倍和52倍。孢子萌發(fā)初期兩個(gè)基因表達(dá)水平顯著下調(diào),隨著萌發(fā)的進(jìn)行,表達(dá)水平緩慢回升,至附著胞形成階段,基因表達(dá)出現(xiàn)了第2次高峰,隨后表達(dá)水平再次下調(diào)。在整個(gè)過(guò)程中,StH-PDE的最高表達(dá)水平則出現(xiàn)在附著胞形成時(shí)期,達(dá)到了菌絲體中的近7倍、分生孢子中的近2倍,而StL-PDE的表達(dá)水平始終低于其在分生孢子中的表達(dá)水平。StH-PDE和StL-PDE在病菌侵染寄主過(guò)程中的表達(dá)水平變化趨勢(shì)與其在人工疏水介質(zhì)誘導(dǎo)下的表現(xiàn)基本一致。在孢子萌發(fā)早期表達(dá)顯著下調(diào),隨著時(shí)間延長(zhǎng),緩慢回升,至接種后18和24 h StH-PDE表達(dá)水平上調(diào),超過(guò)萌發(fā)初期�！窘Y(jié)論】在病菌侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育過(guò)程中,StH-PDE和StL-PDE均呈現(xiàn)下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)的表達(dá)水平變化趨勢(shì)。StH-PDE在附著胞時(shí)期表達(dá)水平最高,StL-PDE在分生孢子中的相對(duì)表達(dá)水平最高。
【圖文】：

StL-PDE克隆

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本文編號(hào)：2556224