【摘要】：紫花苜蓿是優(yōu)良的豆科牧草,具有蛋白含量高、適口性強(qiáng)、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。我國(guó)西北地區(qū)是紫花苜蓿主要的種植區(qū)域,但是由于紫花苜蓿在西北地區(qū)經(jīng)常受不良環(huán)境的影響,極大的影響了其產(chǎn)量與品質(zhì)。因此獲得品質(zhì)更加優(yōu)良、抗逆性更強(qiáng)的紫花苜蓿品種對(duì)推動(dòng)我國(guó)苜蓿種植業(yè)發(fā)展具有舉足輕重的作用。由于傳統(tǒng)的育種手段效率低,對(duì)紫花苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)的改良并沒有很大突破。轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有效率高、目的性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),并且已經(jīng)在多種植物上取得了矚目的成就,因此利用分子手段對(duì)苜�？鼓嫘赃M(jìn)行改良是十分有效的辦法。本研究通過同源克隆的方法克隆了紫花苜蓿植物過氧化物酶MsPrx基因,并對(duì)該基因及蛋白序列進(jìn)行了分析,對(duì)其分子功能進(jìn)行了推測(cè);通過實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)MsPrx基因的不同組織以及NaCl、ABA處理后的基因表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定和分析;通過構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體對(duì)MsPrx基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位;構(gòu)建了超表達(dá)載體并通過組織培養(yǎng)獲得了T0代轉(zhuǎn)基因煙草為后續(xù)進(jìn)一步的研究提供了試驗(yàn)材料。主要研究成果如下:1.根據(jù)蒺藜苜蓿中植物過氧化物酶基因序列設(shè)計(jì)引物,利用RACE法獲得紫花苜蓿中過氧化物酶基因MsPrx。經(jīng)過序列分析表明該基因全長(zhǎng)1190bp,其中CDS區(qū)963bp,編碼320個(gè)氨基酸。蛋白序列分析表明該蛋白具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu),亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)為分泌途徑,因此MsPrx蛋白是分泌性過氧化物酶,屬于Class III植物過氧化物酶家族。2.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)MsPrx基因在苜蓿根、莖、葉中均有表達(dá),但在葉中表達(dá)量最高,根中表達(dá)量次之,莖中表達(dá)量最少。NaCl、ABA處理后MsPrx在根、莖、葉中的表達(dá)量均呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢(shì),表明ABA可能作為信號(hào)因子調(diào)控MsPrx基因在NaCl脅迫下的表達(dá)。3.克隆MsPrx完整的CDS區(qū)序列,去掉終止密碼子后插入到pCAMBIA1302-mGFP載體中,完成瞬時(shí)表達(dá)載體MsPrx-GFP的構(gòu)建。利用煙草葉片進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明MsPrx基因定位在高爾基體中,因此在植物抵抗脅迫方面可能具有重要作用。4.構(gòu)建過表達(dá)載體pCAMBIA1302-MsPrx并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草。經(jīng)過PCR鑒定轉(zhuǎn)基因成功的煙草,為進(jìn)一步的試驗(yàn)提供了可靠的試驗(yàn)材料。
【圖文】：

定RNA的吸光度發(fā)現(xiàn)，所提RNA的OD260/OD280值在1.9左右，含量在1000ng/μL左右，，說明所提取的RNA純度和質(zhì)量較高。將已經(jīng)提取好的RNA進(jìn)行變性凝膠電泳，可以看到明亮而完整的兩條帶（圖2.1），說明提取RNA完整性較好，可以用于后續(xù)的RACE試驗(yàn)。圖 2.1 紫花苜�？� RNAFig.2.1 Total RNA of alfalfa2.2.2 紫花苜蓿 MsPrx 基因全長(zhǎng)克隆通過 NCBI 蒺藜苜蓿 Prx 基因的 EST 序列設(shè)計(jì)引物。以紫花苜蓿 cDNA 為模板通過PCR 反應(yīng)并測(cè)序獲得 720bp 的中間片段。再通過中間片段設(shè)計(jì) RACE 引物，經(jīng)過擴(kuò)增、凝膠電泳分別獲得 750bp 左右的 3’RACE 條帶和 500bp 左右的 5’RACE 條帶，經(jīng)切膠回收、測(cè)序得到 790bp 的 3’端基因序列和 464bp 的 5’端基因序列，將兩端序列通過重疊序列拼接在一起，根據(jù)序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物進(jìn)行擴(kuò)增并通過凝膠電泳獲得 1190bp 的基因全長(zhǎng)（圖 2.2）。經(jīng)測(cè)序獲得 ORF 區(qū)長(zhǎng) 963bp 編碼 320 個(gè)氨基酸（圖 2.3）。14

圖 2.2 紫花苜蓿 MsPrx 基因擴(kuò)增電泳圖Fig. 2.2 Amplification of the MsPrx gene of alfalfaM：DNA Marker DL2000；1：3’RACE；2：5’RACE；3：MsPrx 全長(zhǎng)2.2.3 紫花苜蓿 MsPrx 蛋白序列分析利用 ProtParam 在線工具（ http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）根據(jù)紫花苜蓿 Prx 蛋白序列進(jìn)行在線分析得到該蛋白等電點(diǎn) 5.45， 相對(duì)分子量 34634，氨基酸平均親水性為-0.024，所以該蛋白為親水性蛋白（圖 2.4）。利用 SOPMA 工具（http://www.expasy.org/）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn) MsPrx 氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含33.44%的 α-螺旋、24.69%的延伸鏈、12.50%的 β-轉(zhuǎn)角和 29.38%的不規(guī)則卷曲（圖 2.5）。利用在線亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)網(wǎng)站（https://www.predictprotein.org）對(duì) MsPrx 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白為分泌（Secreted）。利用 DNAman 軟件將 MsPrx 蛋白的氨基酸序列與其他植物過氧化物酶蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同物種間序列都包括3個(gè)過氧化物酶保守結(jié)構(gòu)域（FHDCFV，VSCADILA，ALSGAHT）。此外還發(fā)現(xiàn)有 8 個(gè)與二硫橋形成相關(guān)的半胱氨酸（Cys）殘基和 2 個(gè)與血紅蛋白結(jié)合的組氨酸（His）殘基。此外經(jīng)蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MsPrx 蛋白序列與蒺藜
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S541.9


本文編號(hào)：2555993