【摘要】：目的:肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種罕見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,表現(xiàn)為肌無力、肌萎縮,伴構(gòu)音障礙、吞咽困難等,最終呼吸衰竭,目前缺乏特效治療方法。本研究擬采用hSOD1—G93A轉(zhuǎn)基因小鼠,給予不同濃度健脾益肺方灌胃處理,并通過評估其體重變化、運動功能、生存期等指標(biāo)觀察健脾益肺方的療效;應(yīng)用組織免疫熒光,檢測腰段脊髓前角神經(jīng)元核蛋白(Neuronal Nuclei,NeuN)、小膠質(zhì)細胞特異性標(biāo)志物整合素α M(CD11b)及核轉(zhuǎn)錄因子NF-k B p65的熒光情況,初步探討健脾益肺方對ALS模型小鼠小膠質(zhì)細胞活化調(diào)控作用及相關(guān)機制。方法:1.將hSOD1—G93A轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為:生理鹽水組、低濃度健脾益肺方組、中濃度健脾益肺方組和高濃度健脾益肺方組;同窩普通野生型小鼠設(shè)為陰性對照組。每組小鼠6只。模型小鼠按分組予生理鹽水或?qū)?yīng)濃度健脾益肺方灌胃,陰性對照組予等量生理鹽水灌胃。每日灌胃一次。2.測定小鼠體重,通過Weydt評分確定發(fā)病時間及生存期,通過懸尾試驗、衣架懸掛試驗、疲勞轉(zhuǎn)棒試驗等評價運動功能。統(tǒng)計分析各組間差異。3.各組小鼠終末期經(jīng)取材、固定、冰凍切片后,進行免疫熒光染色。正置熒光顯微鏡×40倍物鏡下觀察并拍照。利用Image J軟件測定前角NeuN陽性細胞計數(shù)、CD11b陽性活化小膠質(zhì)細胞計數(shù)及NF-κB p65熒光強度核/漿比。統(tǒng)計分析各組間差異。結(jié)果:1.體重變化治療前,生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠體重差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。治療后,前期四組模型小鼠的體重隨時間均呈增加趨勢,增加幅度基本無差異。16周齡開始,各組體重差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與生理鹽水組模型小鼠比較,低濃度健脾益肺方組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠體重下降幅度明顯延緩,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05、P0.01)。2.發(fā)病期和生存期生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠的發(fā)病時間依次為:(88.83±4.12)天、(101.33±5.75)天、(108.83±6.68)天、(113.50±10.74)天。與生理鹽水組比較,低濃度健脾益肺方組發(fā)病時間沒有明顯差異,中濃度和高濃度健脾益肺方組模型小鼠的發(fā)病時間明顯延遲,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.986、0.035、0.001)。生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠的生存期依次為:(125.17±3.71)天、(132.17±2.93)天、(138.50±5.05)天、(143.83±3.97)天。與生理鹽水組比較,低濃度、中濃度和高濃度健脾益肺方組的生存期顯著延長,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.017、0.000、0.000)。3.運動功能:衣架懸掛試驗:9-14周齡,生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠掉落次數(shù)處于低水平的穩(wěn)定狀態(tài),各組沒有明顯差異。15-16周齡,生理鹽水組掉落次數(shù)迅速增多,同時期健脾益肺方組情況基本穩(wěn)定。17周齡開始,生理鹽水組模型小鼠不能耐受試驗,健脾益肺方組掉落次數(shù)迅速增多。與生理鹽水組模型小鼠比較,低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組掉落次數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.01)。疲勞轉(zhuǎn)棒試驗:9-13周齡,生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠掉落次數(shù)處于低水平的穩(wěn)定狀態(tài),各組沒有明顯差異。14-17周齡,生理鹽水組掉落次數(shù)迅速增多,同時期,健脾益肺方組模型小鼠情況基本穩(wěn)定。18周齡開始,生理鹽水組模型小鼠不能耐受試驗,同時期的健脾益肺方組掉落次數(shù)迅速增多。與生理鹽水組模型小鼠比較,低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組掉落次數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.NeuN陽性細胞計數(shù)生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠依次為:(3.83±0.98)個/視野、(4.17±1.17)個/視野、(4.83±1.17)個/視野、(7.83±1.17)個/視野。陰性對照組為:(9.17±0.75)個/視野。與陰性對照組比較,生理鹽水組模型小鼠前角NeuN陽性細胞計數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與生理鹽水組模型小鼠比較,低濃度、中濃度健脾益肺方組模型小鼠的NeuN陽性細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而高濃度組明顯增多,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。5.CD11b免疫熒光表達激活型小膠質(zhì)細胞計數(shù):生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠的CD11b陽性細胞表現(xiàn)為胞體呈不同程度地增大,細胞突起增粗、變短,呈激活的小膠質(zhì)細胞。CD11b陽性細胞激活型小膠質(zhì)細胞計數(shù)依次為:(17.50±1.05)個/視野、(15.00±1.41)個/視野、(12.33±1.63)個/視野、(9.17±1.47)個/視野。陰性對照組為:(0.33±0.52)個/視野。與陰性對照組比較,生理鹽水組模型小鼠激活型小膠質(zhì)細胞計數(shù)明顯增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與生理鹽水組模型小鼠比較,低濃度、中濃度和高濃度健脾益肺方組模型小鼠的CD11b陽性激活型小膠質(zhì)細胞計數(shù)顯著減少,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05、P0.01、P0.01)。激活型小膠質(zhì)細胞占比:生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠的CD11b陽性細胞中激活型小膠質(zhì)細胞占小膠質(zhì)細胞總計數(shù)比值依次為:(19.15±1.67)%、(16.67±1.76)%、(13.35±1.61)%、(10.05±1.80)%。陰性對照組為:(0.35±0.55)%。與陰性對照組比較,生理鹽水組模型小鼠的激活型小膠質(zhì)細胞占比明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與生理鹽水組模型小鼠比較,低濃度健脾益肺方組模型小鼠無明顯差異(P=0.052),而中濃度、高濃度健脾益肺方組激活型小膠質(zhì)細胞占比明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.01)。6.NF-κB p65免疫熒光強度核/漿比生理鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠依次為:(1.389± 0.035)%、(1.394±0.020)%、(1.211 ±0.059)%、(1.206±0.056)%。陰性對照組為:(20.42±5.10)%。與陰性對照組比較,生理鹽水組模型小鼠的p65熒光強度核/漿比明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與生理鹽水組模型小鼠比較,低濃度健脾益肺方組無明顯差異(P=0.995),中濃度和高濃度健脾益肺方組均明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.01)。結(jié)論:1.hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病后體重下降嚴重,運動功能減退,生存期縮短;健脾益肺方治療hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠能延緩發(fā)病時間,延長生存期,保持體重,改善運動功能。2.hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病后存在腰段脊髓前角神經(jīng)細胞丟失、小膠質(zhì)細胞活化增生和NF-κB p65核轉(zhuǎn)移程度增高;高濃度健脾益肺方能減輕模型小鼠脊髓神經(jīng)元丟失情況;中、高濃度健脾益肺方能抑制模型小鼠脊髓小膠質(zhì)細胞活化,抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)移過程。3.健脾益肺方的作用靶點可能是通過抑制NF-κB信號通路,減少小膠質(zhì)細胞活化,從而發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥的作用,減少神經(jīng)元損害和丟失,延緩疾病進展。
【圖文】：

圖１不同分組ａｌｓ小鼠的體重變化逡逑＋ＮＳ組：生理鹽水組模型小鼠；ＡＬＳ＋Ｌ組：低濃度健脾益肺方治療組；Ａ方治療組；ＡＬＳ＋Ｈ組：高濃度健脾益肺方治療組。治療前，生理鹽水度健脾益肺方組模型小鼠體重差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＞0．邋０５）。治療重隨時間均呈增加趨勢，增加幅度基本無差異。生理鹽水組和低濃度始，體重隨時間呈逐漸下降趨勢；中濃度健脾益肺方組從第１５周開下降趨勢；高濃度健脾益肺方組從第１６周齡開始體重隨時間呈逐漸下，，１６周齡開始，各組體重差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．邋０１）邋？進一步Ｄ生理鹽水組模型小鼠比較，低濃度健脾益肺方組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意肺方組從１７周齡開始體重差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．邋０５）；高濃度始體重差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．邋０１）。逡逑析逡逑驗結(jié)果說明，中、高濃度健脾益肺方可明顯延遲ＡＬＳ模型小鼠效延緩體重下降的幅度，而低濃度健脾益肺方組的體重下降與較差異并不明顯。逡逑

健睥益肺方對ｈＳ０Ｄ１＿Ｇ９３Ａ轉(zhuǎn)基因小鼠小膠質(zhì)細胞活化的影響方法逡逑ＳＰＳＳ１８．邋０軟件分析實驗結(jié)果。生存期和發(fā)病時間采用Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉ據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準差表示。多組間差異比較采用單因素方差分析，ｅｔｔ－ｔ檢驗。Ｐ＜０．邋０５表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。逡逑果逡逑益肺方對ＡＬＳ模型小鼠發(fā)病時間的影響逡逑鹽水組和低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠的發(fā)�。矗保玻┨�、（１０１．３３±５．７５）天、（１０８．８３±６．邋６８）天、（１１３．邋５析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這四組的發(fā)病時間差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Ｆ＝２ｕｒｍｅｔｔ－ｔ檢驗結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，低濃度健脾益肺延遲，中濃度和高濃度健脾益肺方組模型小鼠的發(fā)病時間明顯學(xué)意義（Ｐ＝0．邋９８６、０．０３５、０．００１）。（見表１、圖２）。逡逑驗結(jié)果表明，中、高濃度健脾益肺方能夠顯著延遲ＡＬＳ模型�。�0１邐１￣￣逡逑0逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2551757